Por que medir a cinética do desenrolamento do DNA é importante para a validação do alvo?

A medição da cinética de desenrolamento do DNA fornece uma leitura funcional direta da estabilidade do nucleossomo, permitindo a avaliação quantitativa do engajamento de alvos epigenéticos. Essa medição apoia a validação de alvos ao associar alterações biofísicas a resultados transcricionais em sistemas relevantes para doenças. Os dados cinéticos permitem a redução de riscos mecanicistas ao esclarecer como os compostos influenciam a acessibilidade da cromatina ao longo do tempo.

Como o isolamento do nucleossomo como uma variável independente se encaixa no processo de descoberta?

O isolamento de nucleossomos em um substrato de mica funcionalizado permite a observação controlada do desenrolamento do DNA sem fatores celulares interferentes. Essa abordagem redutivista é adequada para descobertas iniciais, fornecendo um sistema definido para testar os efeitos de compostos sobre mecanismos centrais da cromatina. O sistema isolado favorece o desenvolvimento de ensaios ao fornecer resultados quantitativos e reprodutíveis para campanhas de triagem.

Quais medidas quantitativas da variável dependente permitem a identificação do composto líder?

As medições temporais da altura da nucleossoma servem como variável dependente para quantificar eventos e a cinética do desenrolamento do DNA. Essas medições permitem a identificação de compostos líderes ao possibilitar a comparação direta dos efeitos de compostos na estabilidade e dinâmica do nucleossoma. Os resultados quantitativos apoiam a análise da relação estrutura-atividade ao correlacionar modificações químicas com alterações no comportamento da cromatina.

Por que os requisitos de replicação são importantes para a colaboração multifuncional?

Os requisitos de replicação garantem condições consistentes de imobilização de nucleossomos e de imageamento entre experimentos, o que é essencial para o compartilhamento confiável de dados entre equipes. Protocolos padronizados para funcionalização da mica e troca de tampão permitem resultados reprodutíveis que apoiam esforços colaborativos de validação de alvos. A replicação consistente reduz a variabilidade nas medidas cinéticas, aumentando a confiança na interpretação de dados entre projetos.

Quais são as capacidades de análise estatística necessárias antes da implementação?

A implementação exige capacidades para análise cinética de dados de imagens sequenciais, incluindo detecção de eventos e determinação de constantes de taxa a partir de trajetórias de altura de nucleossomos. São necessárias ferramentas estatísticas para quantificar frequências de desenrolamento, tempos de permanência e taxas de transição entre estados enrolados e desenrolados. Essas capacidades analíticas permitem que as equipes comparem condições e avaliem os efeitos de compostos com o rigor apropriado para a tomada de decisões.

Microscopia de Força Atômica de Lapso de Tempo de Alta Velocidade para Capturar a Dinâmica do Nucleossomo

JoVE Encyclopedia of Experiments

Técnicas Biológicas

0 vistas • 4:56 min • July 8th, 2025

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Os nucleossomos - unidades repetitivas de DNA eucariótico - consistem em segmentos de DNA enrolados em núcleos de proteínas histonas. O desenvoltório do DNA ao redor do núcleo da histona é crucial para a dinâmica dos nucleossomos.

Para capturar a dinâmica do nucleossomo, comece com um substrato de mica liso e funcionalizado montado em um microscópio de força atômica, AFM, estágio de scanner. Cubra o substrato com um tampão contendo nucleossomos.

O DNA do nucleossomo carregado negativamente interage com cargas positivas na mica funcionalizada, imobilizando-as na superfície. Lave o substrato de mica imobilizado com um tampão para evitar a superlotação dos nucleossomos.

Transfira o estágio do scanner contendo nucleossomos para uma câmara de imagem contendo um balanço pré-montado, com uma ponta na borda e voltada para cima em direção aos nucleossomos.

Encha a câmara com um tampão de imagem. Alinhe o feixe de laser na parte traseira do cantilever para garantir medições precisas de deflexão.

A ponta do AFM oscila perto dos nucleossomos inteiramente envolvidos e examina sobre a superfície para medir a altura dos nucleossomos em intervalos regulares.

O desenvoltório espontâneo do DNA aumenta a altura do nucleossomo, alternando as oscilações da ponta e levando à deflexão do cantilever. Essa deflexão em balanço muda a posição do feixe de laser refletido, que é detectada por um detector sensível à posição e produz imagens topográficas de nucleossomos.

Nas imagens do AFM, o núcleo da histona aparece como uma bolha de incandescência com o ADN unwrapped de alturas crescentes ao longo do tempo, indicativo da dinâmica do nucleossomo.

Use cola de scanner de haste de vidro para prender uma haste de vidro ao estágio do scanner AFM. Deixe secar por no mínimo 10 minutos. Enquanto isso, faça pedaços circulares de mica de 0,1 milímetro de espessura com um diâmetro de 1,5 milímetro, perfurando-os de uma folha de mica maior. Use a cola de haste de vidro de mica-vidro AFM de alta velocidade para prender este pedaço de mica à haste de vidro no AFM de alta velocidade e deixe-o intocado por um mínimo de 10 minutos enquanto seca.

Em seguida, corte as camadas da mica usando uma fita sensível à pressão até que uma camada bem clivada seja vista na fita. Em seguida, dilua 1 microlitro de estoque APS de 50 milimolares em 99 microlitros de água destilada deionizada para fazer uma solução APS de 500 micromolares. Deposite 2,5 microlitros da solução na superfície da mica recém-clivada e deixe a superfície funcionalizar por 30 minutos.

Após a incubação, enxágue a mica várias vezes com água destilada deionizada aplicando enxágues de 3 microlitros. Remova a água completamente após cada enxágue, colocando um pano não tecido na borda da mica. Após o enxágue final, coloque 3 microlitros de água destilada deionizada na superfície e deixe descansar por no mínimo 5 minutos para remover qualquer APS não especificamente ligado.

Em seguida, coloque a sonda no suporte de alta velocidade do AFM e posicione o suporte no estágio do AFM com a ponta voltada para cima. Enxágue o suporte usando 100 microlitros de água destilada deionizada, seguido por dois enxágues de 100 microlitros de tampão de imagem de nucleossomo filtrado de 0,22 mícron. Com os enxágues feitos, encha a câmara com 100 microlitros de tampão de imagem de nucleossomo, submergindo a ponta.

Ajuste a posição do cantilever até que seja atingida pelo laser. Em seguida, enxágue a APS-mica cinco vezes com tampão de imagem de nucleossomo filtrado, usando 4 microlitros por enxágue. Dilua 1 microlitro do estoque de montagem de nucleossomos em 250 microlitros de tampão de imagem de nucleossomo filtrado para uma concentração final de nucleossomos de 1 nanomolar.

Deposite 2,5 microlitros dessa diluição na superfície e deixe descansar por 2 minutos. Enxágue a superfície duas vezes com 4 microlitros de tampão de imagem de nucleossomo para evitar superlotação. Após o enxágue final, deixe a superfície coberta com tampão de imagem. Coloque o scanner e a amostra na parte superior do suporte da ponta para que a amostra fique voltada para baixo.

Para iniciar a aproximação, use a função de aproximação automática com uma amplitude de ponto de ajuste próxima à amplitude de oscilação livre. Ajuste o ponto de ajuste até que a superfície esteja sendo bem rastreada. Em seguida, defina a área da imagem em torno de 150 por 150 nanômetros para 200 por 200 nanômetros com uma taxa de aquisição de dados de cerca de 300 milissegundos por quadro de imagem.