Microscopia de imunofluorescência para análise de quebras de fita dupla de DNA

Para visualizar proteínas específicas de resposta a danos no DNA em locais de quebra de fita dupla de DNA, DSB, usando microscopia de imunofluorescência, comece com lâminas de microscópio contendo monocamadas de células mononucleares humanas com DSBs. Fixe as células com paraformaldeído.

Trate com detergente não iônico, permeabilizando membranas para acesso a alvos intracelulares. Adicione uma solução de bloqueio contendo proteínas, bloqueando os locais de ligação não específicos das células. Incubar com anticorpos primários que se ligam às proteínas de resposta alvo.

Trate com uma mistura de anticorpos secundários marcada com diferentes fluoróforos para se ligar especificamente aos seus respectivos anticorpos primários ligados às proteínas. Corar o DNA com DAPI. Adicione meio de montagem; Monte a lamínula.

Durante a microscopia de fluorescência, o feixe de luz incidente atinge o filtro de excitação, permitindo a passagem da luz de um comprimento de onda de excitação específico. Ao atingir o espelho dicróico - um divisor de feixe - a luz de excitação reflete seletivamente em direção à lente objetiva, que focaliza a luz na amostra.

A luz de excitação incidente excita os elétrons do fluoróforo para um estado de energia mais alto. Ao retornar ao estado fundamental, os elétrons emitem luz em um comprimento de onda mais longo, coletada pela lente objetiva e passada de volta para o espelho dicróico.

O espelho permite que a luz de fluorescência emitida passe pelo filtro de emissão, o que permite que apenas a luz de fluorescência desejada chegue ao detector. Processe as imagens. Analise os diferentes focos fluorescentes coloridos para visualizar a co-localização das proteínas de resposta a danos no DNA no local do DSB.

Prepare duas citospinas com células mononucleares das amostras do paciente por centrifugação de 1 x 10⁵ células para cada preparação. Fixe as células com 200 microlitros de PFA a 4% por 10 minutos.

Após a fixação, lave as células suavemente três vezes com 30 mililitros de PBS por cinco minutos cada em uma coqueteleira. Em seguida, permeabilize as células com 200 microlitros de Octoxinol-9 a 0,1% por 10 minutos. Lave as células suavemente três vezes com 30 mililitros de solução de bloqueio a 5% por cinco minutos cada em um agitador de laboratório. Bloqueie as células em 30 mililitros de solução de bloqueio fresca a 5% por uma hora.

A fixação e permeabilização das células com paraformaldeído a 4% e Octoxinol-9 a 0,1% preservaram os focos gama H2AX e 53BP1 distintamente.

Incubar uma preparação das células com um anticorpo monoclonal anti-gama H2AX de camundongo e a outra preparação das células com um anticorpo monoclonal anti-gama H2AX de camundongo e um anticorpo policlonal anti-53BP1 de coelho durante a noite a 4 graus Celsius.

O uso de anticorpos antigama H2AX e anti-53BP1 comprovados é altamente recomendado.

Após a incubação, lave as células suavemente três vezes com 30 mililitros de solução bloqueadora a 2% a cada cinco minutos em um agitador de laboratório.

Em seguida, incube a primeira preparação das células com um anticorpo secundário anti-camundongo de cabra conjugado com Alexa488 diluído 1 em 500 em solução de bloqueio a 2%. Incube a segunda preparação das células com um anticorpo secundário anti-camundongo de cabra conjugado com Alexa488 e um anticorpo secundário anti-coelho de burro conjugado com Alexa555 diluído 1 em 500 em solução de bloqueio a 2%.

Lave as células suavemente três vezes com 30 mililitros de PBS em um agitador de laboratório. Remova o PBS e monte as células com o meio de montagem. Com cuidado, coloque uma lamínula em cima do meio de montagem, para que não haja bolhas de ar. Aguarde pelo menos três horas para que o meio de montagem endureça antes de analisar as células por microscopia de fluorescência.

Finalmente, analise os focos gama H2AX e 53BP1 nos núcleos das células com um microscópio de fluorescência equipado com filtros para DAPI, Alexa488 e Cy3 durante a imagem em uma ampliação objetiva de 100x.