Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear para Identificar Múltiplas Fosforilações em Proteínas

Múltiplas fosforilações em uma proteína envolvem a adição de grupos fosfato à proteína em várias posições, especificamente em resíduos de serina e treonina.

Para identificar múltiplas fosforilações em uma proteína, comece com um tubo contendo proteínas fosforiladas marcadas com nitrogênio-15, o que ajuda a diferenciar os hidrogênios amida de outros hidrogênios na proteína.

Adicione um composto de referência de RMN interno para medição precisa das frequências de ressonância relativa. Transfira a mistura para um tubo de ressonância magnética nuclear, ou RMN. Insira o tubo em uma abertura giratória e coloque-o em um espectrômetro de RMN.

A presença de fosfatos exibe efeitos de retirada de elétrons nos resíduos de serina e treonina fosforilados. Como resultado, os hidrogênios amida dos resíduos fosforilados parecem ser desprotegidos com densidades eletrônicas menores em comparação com os outros hidrogênios amida.

Os hidrogênios amida com ambientes eletrônicos variados experimentam campos magnéticos diferenciais ao redor dos núcleos, atingindo estados de baixa energia.

Aplique um breve pulso de radiofrequência para excitar os núcleos de hidrogênio a um estado de energia mais alto em uma