Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear para Identificar Múltiplas Fosforilações em Proteínas

Múltiplas fosforilações em uma proteína envolvem a adição de grupos fosfato à proteína em várias posições, especificamente em resíduos de serina e treonina.

Para identificar múltiplas fosforilações em uma proteína, comece com um tubo contendo proteínas fosforiladas marcadas com nitrogênio-15, o que ajuda a diferenciar os hidrogênios amida de outros hidrogênios na proteína.

Adicione um composto de referência de RMN interno para medição precisa das frequências de ressonância relativa. Transfira a mistura para um tubo de ressonância magnética nuclear, ou RMN. Insira o tubo em uma abertura giratória e coloque-o em um espectrômetro de RMN.

A presença de fosfatos exibe efeitos de retirada de elétrons nos resíduos de serina e treonina fosforilados. Como resultado, os hidrogênios amida dos resíduos fosforilados parecem ser desprotegidos com densidades eletrônicas menores em comparação com os outros hidrogênios amida.

Os hidrogênios amida com ambientes eletrônicos variados experimentam campos magnéticos diferenciais ao redor dos núcleos, atingindo estados de baixa energia.

Aplique um breve pulso de radiofrequência para excitar os núcleos de hidrogênio a um estado de energia mais alto em uma frequência de ressonância específica com base em seu ambiente eletrônico.

Durante o relaxamento, os núcleos retornam a um estado de baixa energia, liberando a energia absorvida, que é detectada para produzir um sinal de RMN.

Plote um espectro de RMN bidimensional representando os hidrogênios de amida individuais.

Compare o espectro da proteína fosforilada com o da proteína não fosforilada. O aparecimento de ressonâncias adicionais no espectro de RMN da proteína fosforilada confirma múltiplas fosforilações.

Solubilizar 4 miligramas de Tau fosforilada enriquecida com ¹⁵N e ¹³C liofilizada com ERK em 400 microlitros de tampão RMN. Adicione 5% de óxido de deutério para bloqueio de campo do espectrômetro de RMN e TMSP 1 milimolar como referência de sinal de RMN interna. Além disso, adicione 10 microlitros de uma solução estoque 40x de um coquetel completo de inibidores de protease.

Transfira a amostra em um tubo de RMN de 5 mililitros usando uma seringa eletrônica com uma agulha longa ou usando uma pipeta Pasteur. Feche o tubo de RMN usando o êmbolo. Remova quaisquer bolhas de ar presas entre o êmbolo e o líquido movendo o êmbolo.

Coloque o tubo de RMN em um spinner. Use o medidor apropriado para ajustar sua posição vertical no spinner, de modo que a maior parte da solução de amostra esteja dentro da bobina de RMN. Em seguida, inicie o fluxo de ar no instrumento de RMN clicando em "Levantar" na janela do sistema de controle magnético. Coloque cuidadosamente o spinner com o tubo no fluxo de ar na parte superior do orifício do ímã e, em seguida, pare o fluxo de ar e deixe o tubo descer no lugar dentro da cabeça da sonda dentro do ímã.

Depois de permitir que a amostra se equilibre a 25 graus Celsius, digite 'atmm' na linha de comando para realizar o ajuste semiautomático e a correspondência do cabeçote da sonda para otimizar a transmissão de energia. Em seguida, clique em "Bloquear" na janela do sistema de controle magnético para ativar o bloqueio de frequência de campo do espectrômetro.

Inicie o procedimento de calço para otimizar a homogeneidade do campo magnético na posição do sample digitando primeiro 'topshim gui' na linha de comando para abrir a janela do calço. Em seguida, clique em "Iniciar" na janela de correção. Verifique o desvio padrão residual B zero para verificar se os calços são ideais.

Em seguida, calibre o parâmetro P1, que é o comprimento de um pulso de radiofrequência de prótons em microssegundos. Este parâmetro é necessário para obter uma rotação de 90 graus da magnetização do spin do próton. Aponte para o pulso de 360 graus usando um espectro unidimensional de prótons de água.

Ajuste o deslocamento de frequência definindo o parâmetro 01 para a frequência da água de prótons no espectro unidimensional. Por fim, inicie a aquisição de um espectro de prótons unidimensional digitando 'zg' na linha de comando.