A técnica de espectroscopia de dicroísmo circular para estudar as interações DNA-proteína
JoVE Encyclopedia of Experiments
Técnicas Biológicas
0 vistas • 4:38 min • July 8th, 2025
As proteínas de remodelação da cromatina dependentes de ATP regulam a expressão gênica na cromatina compactada, alterando a conformação do DNA de maneira dependente de ATP.
Para estudar as interações remodelador da cromatina-DNA usando espectroscopia de dicroísmo circular, ou CD, pegue uma solução de oligonucleotídeos de DNA de fita dupla. Aqueça para desnaturar os oligonucleotídeos e coloque no gelo.
O resfriamento rápido faz com que o DNA se renaturalize enquanto forma estruturas secundárias. A região de transição de fita dupla para fita simples fornece um local de ligação ideal para os remodeladores da cromatina.
Adicione o DNA resfriado a calor em uma cubeta. Adicione um tampão contendo remodelador de cromatina dependente de ATP, ATP e íons de magnésio.
O remodelador se liga ao DNA, seguido pela ligação do ATP complexado com íons de magnésio à proteína - ativando-a. O remodelador ativado hidrolisa o ATP - induzindo uma conformação de alça de haste no DNA.
Passe a luz polarizada circularmente para a esquerda e para a direita - com uma diferença de fase de 90 ° - através da amostra. O DNA opticamente quiral absorve a luz polarizada circularmente esquerda e direita em diferentes extensões.
A absorção diferencial, denominada dicroísmo circular, resulta na polarização elíptica da luz transmitida, que é medida como elipticidade. Dois picos positivos em comprimentos de onda específicos nos espectros de CD confirmam a estrutura haste-loop.
Adicione EDTA para quelar os íons de magnésio, inibindo a atividade da ATPase.
Uma mudança nos espectros de CD após a quelação - mostrando um pico negativo e um pico positivo amplo em comprimentos de onda específicos - indica a interrupção da conformação da alça do tronco na ausência de hidrólise de ATP.
Colete os espectros do CD em cubetas de quartzo de alta transparência. Use cubetas retangulares ou cilíndricas. Para limpar as cubetas, lave-as com água várias vezes e, em seguida, faça uma varredura da água ou tampão na cubeta para verificar se está limpa.
Para as reações, use oligonucleotídeos de DNA purificados por PAGE. Para resfriamento rápido, aqueça o DNA a 94 graus Celsius por 3 minutos no bloco de aquecimento e resfrie-o imediatamente no gelo. Para um resfriamento lento, depois de aquecer o DNA a 94 graus Celsius por 3 minutos, deixe-o esfriar até a temperatura ambiente a uma taxa de 1 grau Celsius por minuto.
Para registrar os espectros da linha de base, configure um total de 5 reações de controle, uma a uma, em tubos de centrífuga de 1,5 mililitro. Mantenha o volume de reação em 300 microlitros em todas as reações.
Para registrar os espectros de CD, configure um total de cinco reações experimentais, uma a uma, em tubos de centrífuga de 1,5 mililitro.
Para gravar a varredura, ligue o gás e ligue o espectrômetro de CD. Após 10 a 15 minutos, acenda a lâmpada, ligue o banho-maria e ajuste a temperatura do suporte para 37 graus Celsius.
Em seguida, abra o software de espectro de CD e defina a temperatura para 37 graus Celsius, a faixa de comprimento de onda de 180 a 300 nanômetros, o tempo por ponto para 0,5 segundos e o número de varredura para 5. Em seguida, clique no Pro-Data Viewer, crie um novo arquivo e renomeie-o com os detalhes do experimento e a data.
Em seguida, misture as reações de linha de base e experimentais pipetagem e transfira cuidadosamente as misturas de reação uma a uma para a cubeta, garantindo que não haja bolhas de ar.
Se estiver realizando um experimento de curso de tempo, incube as reações a 37 graus Celsius pelo tempo necessário. Em seguida, faça a digitalização. Adicione EDTA ao tampão contendo DNA, ATP, magnésio e proteína para interromper a hidrólise do ATP. Para inibir completamente a atividade da ATPase, aumente a concentração de EDTA e o tempo de incubação.
Subtraia as linhas de base das reações correspondentes no software e suavize os dados no software de espectro de CD ou no software de plotagem de dados. Em seguida, trace um gráfico de comprimento de onda em relação à elipticidade média do resíduo e analise os picos.
Visão Geral
Este estudo investiga o papel das proteínas remodeladoras da cromatina dependentes de ATP na regulação da expressão gênica mediante a alteração da conformação do DNA. Utilizando espectroscopia de dicroísmo circular (CD), analisam-se as interações entre remodeladores da cromatina e o DNA.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Remodelação da cromatina
- Regulação da expressão gênica
- Técnicas biofísicas
Contexto
- A remodelação da cromatina é essencial para a expressão gênica em células eucarióticas.
- Remodeladores da cromatina dependentes de ATP alteram a estrutura do DNA para facilitar a transcrição.
- A espectroscopia de dicroísmo circular pode fornecer informações sobre a conformação do DNA.
- Compreender essas interações é crucial para elucidar os mecanismos de regulação gênica.
Objetivo do Estudo
- Explorar como os remodeladores da cromatina interagem com o DNA.
- Caracterizar as mudanças conformacionais no DNA induzidas pela hidrólise de ATP.
- Utilizar a espectroscopia de dicroísmo circular (CD) como método para analisar essas interações.
Métodos Utilizados
- Preparação de oligonucleotídeos de DNA de dupla fita.
- Desnaturação e renaturação do DNA para formar estruturas secundárias.
- Associação de remodeladores da cromatina e ATP ao DNA.
- Medição de espectros de CD para analisar alterações conformacionais do DNA.
Resultados Principais
- Os espectros de CD mostraram picos distintos indicando a formação de uma estrutura em stem-loop.
- A quelação com EDTA interrompeu a conformação em stem-loop, confirmando o papel do ATP.
- As reações basais e experimentais foram registradas e analisadas com sucesso.
- O alisamento dos dados e a plotagem dos gráficos revelaram descobertas significativas sobre a estrutura do DNA.
Conclusões
- Remodeladores de cromatina dependentes de ATP alteram significativamente a conformação do DNA.
- A espectroscopia de dicroísmo circular é um método eficaz para estudar essas interações.
- O estudo aprimora a compreensão dos mecanismos de regulação gênica na cromatina.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A espectroscopia de dicroísmo circular permite a desmistificação mecanicista de alvos remodeladores da cromatina, fornecendo leituras quantitativas e livres de marcadores sobre alterações conformacionais do DNA. Isso apoia a validação de alvos na fase inicial de descoberta, associando a atividade dependente de ATP a resultados estruturais, orientando decisões de avançar ou não avançar em programas de descoberta de fármacos epigenéticos. A técnica oferece confiança preditiva sobre o mecanismo do alvo antes do desenvolvimento de ensaios ou campanhas de triagem.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Avalia hipóteses terapêuticas mediante a medição de alterações estruturais no DNA dependentes de ATP induzidas por remodeladores da cromatina.
- Valor Operacional: Fornece leituras quantitativas de elipticidade sem marcação, esclarecendo o mecanismo de ação sem o uso de marcadores fluorescentes.
- Valor Preditivo: Permite a redução de riscos biológicos ao confirmar o engajamento do alvo por meio de mudanças conformacionais no DNA.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Gera espectros de CD reprodutíveis em cubetas de quartzo sob temperatura controlada (37°C) e faixa de comprimento de onda (180–300 nm).
- Saída Quantitativa: Fornece medidas de elipticidade média por resíduo que detectam a formação e desestabilização de estruturas em stem-loop por meio de deslocamentos de pico.
- Reprodutibilidade: A subtração do espectro de referência e o alisamento dos dados permitem comparações consistentes entre diferentes condições experimentais.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Mecanística: Relaciona a atividade ATPase à conformação do DNA, apoiando a validação de alvos alinhada a biomarcadores em vias epigenéticas.
- Avanço Ajustado ao Risco: O controle por quelatamento com EDTA confirma a dependência de ATP, permitindo a priorização de compostos com base no mecanismo.
- Relevância Translacional: A conformação em estrutura secundária do tipo stem-loop atua como leitura estrutural para ensaios funcionais subsequentes em biologia da cromatina.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Posicionada entre a hipótese alvo e a identificação de compostos iniciais, a espectroscopia de dicroísmo circular valida o envolvimento mecanicista antes da triagem de compostos, reduzindo falsos positivos em programas de alvos epigenéticos.
- Biologia da Descoberta: Testa a hipótese de interação entre remodeladores da cromatina e DNA por meio da observação direta da mudança conformacional induzida por ATP.
- Triagem: Prepara substratos de DNA padronizados e com conformação definida para ensaios confiáveis de ligação ou inibição de compostos.
- Análises: Mede a elipticidade em comprimentos de onda específicos para quantificar estados estruturais, permitindo a comparação entre condições com e sem ATP.
- Pesquisa Translacional: Fornece uma ligação mecanicista da validação do alvo até modelos pré-clínicos, confirmando o remodelamento do DNA dependente de ATP.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma biofísica reutilizável para triagem de compostos direcionados à cromatina em múltiplas famílias de remodeladores.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos cromatínicos por meio de leituras estruturais diretas.
- Valor Operacional: Permite a padronização por meio de protocolos de limpeza de cubetas, controles de linha de base e medições com temperatura fixa.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência do capital ao reduzir riscos nos alvos precocemente, minimizando investimentos em compostos não mecanicistas.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de alvos epigenéticos com base na validação conformacional dependente de ATP.
Considerações de Implementação
- Exige experiência em espectroscopia biomolecular e manipulação de ácidos nucleicos.
- Depende de espectrômetro de CD, cubetas de quartzo e banho de água com controle de temperatura.
- Necessita condições padronizadas de tampão e subtração de linha de base para precisão dos dados.
- A adaptação a outras estruturas de ácidos nucleicos pode exigir otimização das condições de renaturation.
- Limitado a sistemas solúveis e purificados; não adequado para formatos de alto rendimento ou baseados em células.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Análise do Promotor de Ligando C-KIT Usando Imunoprecipitação de Cromatina
Vídeos relacionados
0 Visualizações
Protocolo para síntese de fase sólida de oligómeros de ARN contendo um 2'-
Vídeos relacionados
0 Visualizações
Síntese e caracterização de 1,2-Ditiolano modificado peptídeos auto-montagem
Vídeos relacionados
0 Visualizações
Calorimetria Exploratória Diferencial para Estudo da Interação DNA Aptamer-Ligante Termolábil
Vídeos relacionados
0 Visualizações
Combinando uma única molécula de Manipulação e imagem para o estudo das interações proteína-DNA
Vídeos relacionados
0 Visualizações
Determinação de interacções proteína-ligante Usando Differential Scanning Fluorimetria
Vídeos relacionados
0 Visualizações
Anisotropia de fluorescência como uma ferramenta para estudar as interações proteína-proteína
Vídeos relacionados
0 Visualizações
Espectroscopia de fluorescência de dupla cor para estudar interação proteína-proteína e dinâmica de proteína em células vivas
Vídeos relacionados
0 Visualizações
Espectroscopia de CD para estudar interações DNA-proteína
Vídeos relacionados
0 Visualizações
Decifrando o Mecanismo Molecular da Montagem de Histonas pela Técnica de Cortina de DNA
Vídeos relacionados
0 Visualizações
Última atualização: 29 agosto 2026