Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Técnicas Biológicas
0 visualizações • 4:38 min. • July 8th, 2025
As proteínas de remodelação da cromatina dependentes de ATP regulam a expressão gênica na cromatina compactada, alterando a conformação do DNA de maneira dependente de ATP.
Para estudar as interações remodelador da cromatina-DNA usando espectroscopia de dicroísmo circular, ou CD, pegue uma solução de oligonucleotídeos de DNA de fita dupla. Aqueça para desnaturar os oligonucleotídeos e coloque no gelo.
O resfriamento rápido faz com que o DNA se renaturalize enquanto forma estruturas secundárias. A região de transição de fita dupla para fita simples fornece um local de ligação ideal para os remodeladores da cromatina.
Adicione o DNA resfriado a calor em uma cubeta. Adicione um tampão contendo remodelador de cromatina dependente de ATP, ATP e íons de magnésio.
O remodelador se liga ao DNA, seguido pela ligação do ATP complexado com íons de magnésio à proteína - ativando-a. O remodelador ativado hidrolisa o ATP - induzindo uma conformação de alça de haste no DNA.
Passe a luz polarizada circularmente para a esquerda e para a direita - com uma diferença de fase de 90 ° - através da amostra. O DNA opticamente quiral absorve a luz polarizada circularmente esquerda e direita em diferentes extensões.
A absorção diferencial, denominada dicroísmo circular, resulta na polarização elíptica da luz transmitida, que é medida como elipticidade. Dois picos positivos em comprimentos de onda específicos nos espectros de CD confirmam a estrutura haste-loop.
Adicione EDTA para quelar os íons de magnésio, inibindo a atividade da ATPase.
Uma mudança nos espectros de CD após a quelação - mostrando um pico negativo e um pico positivo amplo em comprimentos de onda específicos - indica a interrupção da conformação da alça do tronco na ausência de hidrólise de ATP.
Colete os espectros do CD em cubetas de quartzo de alta transparência. Use cubetas retangulares ou cilíndricas. Para limpar as cubetas, lave-as com água várias vezes e, em seguida, faça uma varredura da água ou tampão na cubeta para verificar se está limpa.
Para as reações, use oligonucleotídeos de DNA purificados por PAGE. Para resfriamento rápido, aqueça o DNA a 94 graus Celsius por 3 minutos no bloco de aquecimento e resfrie-o imediatamente no gelo. Para um resfriamento lento, depois de aquecer o DNA a 94 graus Celsius por 3 minutos, deixe-o esfriar até a temperatura ambiente a uma taxa de 1 grau Celsius por minuto.
Para registrar os espectros da linha de base, configure um total de 5 reações de controle, uma a uma, em tubos de centrífuga de 1,5 mililitro. Mantenha o volume de reação em 300 microlitros em todas as reações.
Para registrar os espectros de CD, configure um total de cinco reações experimentais, uma a uma, em tubos de centrífuga de 1,5 mililitro.
Para gravar a varredura, ligue o gás e ligue o espectrômetro de CD. Após 10 a 15 minutos, acenda a lâmpada, ligue o banho-maria e ajuste a temperatura do suporte para 37 graus Celsius.
Em seguida, abra o software de espectro de CD e defina a temperatura para 37 graus Celsius, a faixa de comprimento de onda de 180 a 300 nanômetros, o tempo por ponto para 0,5 segundos e o número de varredura para 5. Em seguida, clique no Pro-Data Viewer, crie um novo arquivo e renomeie-o com os detalhes do experimento e a data.
Em seguida, misture as reações de linha de base e experimentais pipetagem e transfira cuidadosamente as misturas de reação uma a uma para a cubeta, garantindo que não haja bolhas de ar.
Se estiver realizando um experimento de curso de tempo, incube as reações a 37 graus Celsius pelo tempo necessário. Em seguida, faça a digitalização. Adicione EDTA ao tampão contendo DNA, ATP, magnésio e proteína para interromper a hidrólise do ATP. Para inibir completamente a atividade da ATPase, aumente a concentração de EDTA e o tempo de incubação.
Subtraia as linhas de base das reações correspondentes no software e suavize os dados no software de espectro de CD ou no software de plotagem de dados. Em seguida, trace um gráfico de comprimento de onda em relação à elipticidade média do resíduo e analise os picos.