Um imunoensaio direto baseado em espectroscopia Raman para detectar um antígeno específico

Comece incubando moléculas de corante repórter Raman com nanopartículas de ouro para os repórteres se ligarem às nanopartículas.

Adicione polietilenoglicol, anticorpos conjugados com PEG específicos para o antígeno alvo. Os anticorpos se ligam covalentemente às nanopartículas por meio da ligação ouro-dissulfeto. Adicione PEGs conjugados com tiol para bloquear os locais de nanopartículas restantes e evitar a agregação de nanopartículas, formando sondas de nanopartículas.

Revestir os alvéolos das placas de imunoensaio com o antigénio alvo. Bloqueie os locais restantes da placa com uma solução contendo proteínas. Adicione as sondas de nanopartículas. Realize a diluição da sonda em série nos poços. Incubar para que os anticorpos nas sondas se liguem aos antígenos, formando complexos.

Use um microscópio Raman para determinar a resposta óptica da sonda. O laser monocromático incidente excita os elétrons da superfície das nanopartículas de ouro e causa sua oscilação, criando um alto campo eletromagnético local na superfície da sonda.

O feixe incidente e os repórteres Raman interagem, causando luz inelástica aprimorada ou dispersão Raman com diferentes comprimentos de onda e frequências devido ao campo eletromagnético aprimorado. O sinal Raman emitido inelasticamente é usado para gerar o espectro Raman.

Plote a área espectral do pico do repórter Raman em relação à concentração da sonda para encontrar o limite inferior de detecção da sonda e facilitar a detecção mais sensível do antígeno.

Para preparar as sondas Raman, primeiro faça dois lotes de 1,5 mililitro de nanopartículas de ouro e o repórter Raman em concentrações determinadas conforme descrito no protocolo de texto que acompanha.

Isso é feito combinando o repórter Raman e as soluções de nanopartículas de ouro e permitindo que elas se liguem por mais de 30 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, adicione a solução de anticorpos PEGulados a uma das soluções de nanopartículas de ouro ligadas ao repórter para criar uma proporção de 200 para 1 de anticorpos para partículas. Esta solução será para as amostras de teste.

Em um tubo de microcentrífuga separado, adicione um antígeno PEGulado à outra solução de nanopartículas de ouro ligada ao repórter em uma proporção de 200 para 1 de antígeno para partículas a serem usadas como controle. Incube ambas as soluções por 30 minutos em temperatura ambiente.

Em seguida, bloqueie os locais restantes na superfície da nanopartícula. Para conseguir isso, primeiro dissolva o metoxipolietilenoglicol tiol sólido a uma concentração de 200 micromolares usando água HPLC. Vortex a solução até que o tiol esteja completamente dissolvido. Em seguida, adicione a solução de tiol em uma proporção de 40.000 para 1 às soluções de anticorpos PEG ligados a nanopartículas e incube a solução em temperatura ambiente por 10 minutos para garantir que os locais restantes na nanopartícula de ouro sejam bloqueados.

Em seguida, recupere as sondas Raman funcionalizadas centrifugando as partículas em tubos de centrífuga de baixo limite para que o sobrenadante fique claro. Remova o sobrenadante pipetando, mas tome cuidado para não perturbar as nanopartículas. Em seguida, ressuspenda as nanopartículas com 1 mililitro de PBS.

Estime a concentração de nanopartículas de ouro fazendo uma medição UV-Visível de cerca de três microlitros da solução e compare os resultados com os de uma concentração conhecida de nanopartículas de ouro, pois esta é uma relação linear.

Se as nanopartículas não forem suficientemente bloqueadas, elas se agregarão devido às forças de adesão entre partículas, sugerindo que os reagentes foram adicionados nas concentrações incorretas. Normalmente, a solução é uma cor vermelha profunda, mas a agregação cria uma tonalidade cinza.

Ajustar o volume de modo a que as soluções finais sejam pelo menos 1 x 10¹¹ partículas por mililitro e armazenar as soluções a 4 graus Celsius até serem utilizadas para a funcionalização da placa de imunoensaio. Use essas soluções dentro de uma semana. Primeiro, prepare o antígeno diluído o suficiente para encher os poços de poliestireno. Em seguida, vortex a solução e adicione imediatamente a solução aos poços das placas.

Deixe o antígeno se ligar às placas por 1 hora em temperatura ambiente. Em seguida, remova o excesso de solução de antígeno despejando a solução e batendo o prato contra uma toalha de papel Adicione TBST aos poços para lavar a superfície. Em seguida, remova a lavagem despejando novamente a solução e batendo o prato contra uma mesa coberta com papel toalha.

Em seguida, bloqueie os locais de ligação restantes na placa para evitar a ligação inespecífica, adicionando 70 microlitros de solução de bloqueio de HSA a cada poço da placa e incubando a placa em temperatura ambiente por 30 minutos. Em seguida, remova a solução de bloqueio e enxágue a placa três vezes com TBST, conforme demonstrado anteriormente. Depois de remover o enxágue final, cubra o prato e guarde-o seco a 4 graus Celsius até o uso posterior.

Adicione 140 microlitros das nanopartículas da sonda previamente preparadas na primeira coluna de uma placa de 96 poços, colocando as nanopartículas de teste nas primeiras cinco fileiras e as nanopartículas de controle nas últimas três fileiras. Adicione 70 microlitros de PBS a todas as outras colunas.

Diluir cada coluna com uma diluição de 1 a 2 em série. Comece pegando 70 microlitros da primeira coluna e misturando com a segunda. Em seguida, pegue 70 microlitros da segunda coluna e adicione-os à terceira, e assim por diante. Deixe a placa incubar por pelo menos uma hora.

Em seguida, remova as sondas de nanopartículas não ligadas e lave a placa com TBST cinco vezes, conforme demonstrado anteriormente. Após a lavagem final, adicione 70 microlitros de PBS a cada poço e cubra a placa com uma vedação da placa. Verificar se as amostras de controlo estão limpas. Se tiver ocorrido uma ligação inespecífica, as amostras de controlo terão uma cor semelhante à das amostras de ensaio.

Usando um microscópio Raman invertido, concentre a objetiva na superfície do poço que possui as sondas de nanopartículas de ouro. Obtenha espectros Raman do poço. Colete um espectro variando de 1800 centímetros inversos a 400 centímetros inversos e repita isso para cada poço. Por fim, siga as etapas na seção final do protocolo de texto que acompanha para determinar a sensibilidade da configuração.