Detecção otimizada baseados em PCR de Mycoplasma
20 de junho de 2011
O LookOut Mycoplasma Kit de Detecção de PCR utiliza a reação em cadeia da polimerase (PCR), que é estabelecido como o método de escolha para maior sensibilidade na detecção de contaminação por Mycoplasma, Acholeplasma e Ureaplasma em culturas de células e cultura de células derivadas outros produtos biológicos.
O objetivo geral deste procedimento é demonstrar visualmente os passos para o uso do kit de detecção PCR de micoplasma lookout, otimizado para detectar contaminação por micoplasma. Isso é realizado primeiramente aquecendo as amostras a 95 graus Celsius para inativar quaisquer moléculas de DNA que possam tornar o molde desejado inadequado para a PCR. Em seguida, prepare as amostras para PCR utilizando os tubos fornecidos, que já vêm pré-codificados com nucleotídeos, iniciadores e DNA de controle interno.
O terceiro passo do procedimento é o ciclo térmico sob condições cuidadosamente otimizadas para proporcionar a maior sensibilidade e eliminar a amplificação não específica. Em última análise, os resultados podem ser obtidos para determinar se as amostras em questão estão contaminadas com micoplasma mediante avaliação por eletroforese em gel de agarose. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes é que os reagentes são pré-aquáticos e os tubos de PCR são de alta qualidade.
Isso torna o processo mais conveniente e eficiente. Outra vantagem deste kit é que ele exige menos de dois genomas de micoplasma por microlitro de amostra para detectar contaminação. Ao realizar o procedimento de detecção de micoplasma, é importante evitar qualquer contaminação possível, utilizando equipamento de proteção individual apropriado para manter a exposição da pele no mínimo, garantir que todos os reagentes utilizados estejam livres de contaminação e manter uma técnica asséptica adequada em todos os momentos.
O procedimento pode ser realizado diretamente em sobrenadantes de cultivo celular ou as amostras podem ser preparadas para uso em uma data posterior. Para preparar as amostras para uso futuro, coloque 100 microlitros de cada sobrenadante em um tubo de amplificação estéril e incube a 95 graus Celsius por cinco minutos. Após a incubação, as amostras podem ser armazenadas entre dois e oito graus Celsius por até uma semana.
Imediatamente antes de testar as amostras, centrifugue brevemente para sedimentar qualquer detrito celular. Para preparar as amostras para PCR, primeiro determine o volume total do tampão de reidratação da DNA polimerase necessário para as reações. Uma unidade de DNA polimerase por reação deve ser adicionada ao volume apropriado do tampão de reidratação, que varia conforme o TAC utilizado; neste demonstração, o Jumpstart TAC D 93 0 7 será usado em cinco reações, três amostras mais um controle positivo e um controle negativo.
Coloque o volume calculado de DNA polimerase em um tubo de microcentrífuga limpo e adicione o volume calculado de tampão de reidratação. Misture suavemente o tampão de reidratação da DNA polimerase batendo levemente no tubo. Não vortex esta mistura.
Utilize os tubos de reação transparentes fornecidos no kit para preparar o controle negativo e as amostras. Esses tubos de reação já contêm os nucleotídeos, os iniciadores e o DNA do controle interno; pipete 23 microlitros do tampão de reidratação da DNA polimerase previamente preparado. Misture em cada um dos tubos de controle negativo e de amostras.
Em seguida, adicione dois microlitros de água livre de DNA ao controle negativo e dois microlitros de cada amostra aos tubos respectivos. Misture o conteúdo agitando levemente os tubos. O conteúdo não deve ser vortexado.
Para preparar o controle positivo, utilize os tubos de reação cor-de-rosa fornecidos no kit. Esses tubos de reação já contêm os nucleotídeos, iniciadores e DNA do controle interno; adicione 25 microlitros da mistura tampão de reidratação da DNA polimerase ao tubo de reação. Misture o conteúdo agitando suavemente o tubo; o conteúdo não deve ser vortexado.
Em seguida, incubar os tubos de controle positivo, controle negativo e as amostras à temperatura ambiente por cinco minutos. Após cinco minutos, transferir todos os tubos de reação para um termociclador. Para a PCR, definir as seguintes condições por 40 ciclos.
94 graus Celsius por 30 segundos. 55 graus Celsius por 30 segundos e 72 graus Celsius por 40 segundos. Um passo de ativação não é necessário ao usar Jumpstart tack.
Após a conclusão dos ciclos de PCR, remova as amostras do termociclador e coloque-as no gelo para resfriar a quatro a oito graus Celsius. As amostras podem então ser carregadas diretamente em um gel de agarose para eletroforese, aplicando oito microlitros de cada reação de PCR em um poço separado. Não é necessário adicionar tampão e corante antes do carregamento das amostras, pois eles já estão incluídos nos tubos de reação.
Interrompa a eletroforese após a migração do corante de acompanhamento por 2,5 a três centímetros. Os resultados representativos da detecção de micoplasma por PCR são mostrados nesta imagem de uma linha de gel aros. Dois é o controle negativo, que deve apresentar uma banda em aproximadamente 481 pares de bases.
A ausência da banda do controle negativo em 481 pares de bases é um bom indicador de que o TAC utilizado não foi sensível o suficiente. As amostras positivas para micoplasma mostrarão bandas na faixa de 270 mais ou menos oito pares de bases, conforme mostrado nas linhas três a seis. A banda será intensa em amostras altamente contaminadas e fraca em amostras levemente contaminadas.
Todas as amostras contêm um controle negativo interno para demonstrar que a PCR ocorreu conforme esperado. É normal observar a ausência do controle interno em amostras altamente contaminadas. A ausência de uma banda tanto na faixa positiva quanto na negativa, como mostrado na trilha sete, é um bom indicador de que as amostras estão inibidas.
Se a amostra estiver inibida, os inibidores da PCR podem ser removidos realizando-se uma extração de DNA. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como executar todas as etapas necessárias descritas no procedimento do kit, bem como interpretar os resultados e solucionar problemas quando necessário.
Visão Geral
O Kit de Detecção PCR para Mycoplasma LookOut foi desenvolvido para a detecção sensível de contaminação por Mycoplasma em culturas celulares. Este procedimento demonstra os passos para utilizar o kit, incluindo a preparação da amostra e a amplificação por PCR.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Microbiologia
- Cultura Celular
- Biologia Molecular
Contexto
- A contaminação por micoplasma pode afetar significativamente os resultados do cultivo celular.
- O método de PCR é o preferido pela sua alta sensibilidade na detecção de contaminantes.
- O Kit de Detecção de Micoplasma por PCR LookOut simplifica o processo de detecção.
- Técnicas assépticas adequadas são cruciais para evitar contaminação durante os testes.
Objetivo do Estudo
- Demonstrar o uso do Kit de Detecção PCR para Mycoplasma LookOut.
- Fornecer um método confiável para detectar contaminação por Mycoplasma.
- Descrever os passos para preparação da amostra e execução da PCR.
Métodos Utilizados
- Aquecimento das amostras para inativar moléculas de DNA.
- Preparação das amostras com tubos pré-codificados contendo os reagentes necessários.
- Realização do ciclo térmico para amplificação por PCR.
- Avaliação dos resultados utilizando eletroforese em gel de agarose.
Resultados Principais
- Amostras positivas para Mycoplasma mostram bandas distintas nos resultados da PCR.
- Os controles negativos devem exibir um tamanho específico de banda, indicando ausência de contaminação.
- A ausência de bandas pode indicar inibição da amostra ou sensibilidade insuficiente.
- Os controles internos confirmam que o processo de PCR foi bem-sucedido.
Conclusões
- O Kit de Detecção PCR para Mycoplasma LookOut é eficaz na detecção de contaminação.
- O manuseio adequado das amostras e a técnica correta são essenciais para resultados precisos.
- Os resultados podem orientar ações adicionais para garantir a integridade do cultivo celular.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A contaminação por micoplasma representa um risco significativo para a integridade dos dados em pesquisas baseadas em células, podendo interferir nos resultados experimentais e desperdiçar recursos. O Kit de Detecção de Micoplasma por PCR LookOut oferece um método altamente sensível e rápido para triagem de rotina, permitindo a detecção precoce e intervenção. Isso contribui para maior confiança preditiva na qualidade das linhagens celulares e reduz a probabilidade de propagação de culturas contaminadas ao longo dos fluxos de descoberta e pré-clínicos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas ao garantir a pureza das linhagens celulares, reduzindo fenótipos falsos associados à contaminação.
- Valor Operacional: Apoia a validação funcional de alvos por meio de modelos confiáveis e livres de contaminação, que mantêm perfis consistentes de proliferação e metabólicos.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados para triagem subsequente, confirmando a ausência de artefatos induzidos por micoplasma em ensaios de proliferação ou sinalização.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização e reprodutibilidade dos ensaios mediante o uso rotineiro de um método sensível e padronizado de detecção com controles internos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Mantém a integridade do sistema relevante para a doença, prevenindo aberrações cromossômicas e alterações metabólicas que poderiam distorcer leituras pré-clínicas de eficácia ou toxicidade.
- Valor Operacional: Apoia decisões de avanço ajustadas ao risco, fornecendo um ponto de controle de qualidade antes da transição das culturas para estudos in vivo ou trabalhos habilitadores de IND.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método insere-se no continuum de descoberta, desde a biologia inicial até a identificação de compostos ativos, atuando como uma etapa de controle da integridade da cultura antes da triagem de compostos ou estudos mecanicistas.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses garantindo que os fenótipos observados sejam decorrentes das variáveis experimentais, e não de artefatos induzidos por contaminação.
- Triagem: Permite a prontidão dos ensaios por meio de detecção rápida e sensível, possibilitando testes de alto rendimento em bancos de linhagens celulares com mínimos falsos negativos.
- Análises: Fornece saída quantitativa por meio da intensidade da banda em eletroforese em gel, permitindo avaliação semi-quantitativa da carga de contaminação para auxiliar na resolução de problemas.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica ao garantir que estudos de toxicologia ou farmacologia utilizem culturas livres de variabilidade induzida por micoplasma.
- Reutilização Corporativa: Funciona como uma plataforma de controle de qualidade reutilizável entre departamentos, apoiando a gestão centralizada de linhagens celulares e reduzindo testes redundantes.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva ao reduzir a ambiguidade mecanicista decorrente de fenótipos relacionados à contaminação.
- Valor Operacional: Oferece padronização e escalabilidade por meio de tubos pré-codificados e controles internos, minimizando erros do usuário e variabilidade entre lotes.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguimento ou interrupção ao fornecer alerta precoce de contaminação, evitando investimentos em conjuntos de dados defeituosos.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização baseada em risco de linhagens celulares, direcionando recursos para modelos validados e reduzindo a perda em estágios avançados devido a ruídos biológicos.
Considerações de Implementação
- Requer conhecimento em biologia molecular para a preparação da PCR e interpretação da eletroforese em gel.
- Necessita de um termociclador e infraestrutura para eletroforese em gel de agarose com capacidade de imagem ultravioleta.
- Exige técnica asséptica rigorosa e áreas segregadas para etapas pré e pós-PCR para prevenir contaminação por amplicons.
- Requer treinamento na interpretação do controle interno para distinguir verdadeiros negativos da inibição da PCR.
- Limita-se à detecção de ácidos nucleicos; não avalia viabilidade ou identidade da espécie sem sequenciamento complementar.
