Isolamento de macrófagos do gânglio da raiz dorsal de camundongos usando dissociação mecânica

O gânglio da raiz dorsal, ou DRG, é um aglomerado de corpos celulares neuronais ao longo da medula espinhal que transportam informações sensoriais do sistema nervoso periférico para o central. A lesão de nervos periféricos causa acúmulo de macrófagos no DRG e o desenvolvimento de dor neuropática.

Para isolar macrófagos viáveis usando um método livre de enzimas, pegue o tecido DRG de camundongo recém-dissecado em um homogeneizador cheio de tampão gelado para limitar o estresse celular. Usando um pilão, homogeneizar mecanicamente o tecido para liberar as células.

Filtre através de um filtro de células para remover aglomerados de células e obter uma suspensão unicelular no fluxo. O homogeneizado do tecido contém neurônios e células não neuronais, que incluem macrófagos e mielina flutuante - a bainha isolante dos neurônios.

Adicionar o homogeneizado filtrado a um tubo contendo um meio de gradiente de densidade e centrifugar. Sob força centrífuga, as células viáveis com maior densidade de flutuação se depositam no fundo do tubo para formar um pellet, enquanto a mielina permanece suspensa. Descarte o sobrenadante.

Ressuspenda as células em um tampão contendo anticorpos conjugados com fluoróforo contra receptores de superfície celular específicos de macrófagos. Incube pela duração necessária. O anticorpo se liga ao seu receptor nas células dos macrófagos, marcando assim fluorescentemente a superfície celular. Lave para remover anticorpos não ligados.

Analise as células usando um citômetro de fluxo. Um sinal de fluorescência específico para anticorpos indica a presença de macrófagos na amostra.

Antes de iniciar o experimento, prepare a solução de trabalho do meio de gradiente de densidade misturando nove volumes do meio com um volume de 10X HBSS livre de cálcio e magnésio e mantenha-o no gelo. Confirme se o mouse está totalmente anestesiado pela falta de resposta ao beliscão da pata traseira.

Comece colocando um camundongo anestesiado dentro de uma capela de exaustão química em decúbito dorsal com quatro patas presas com fita adesiva. Use uma pinça para levantar a pele abaixo da caixa torácica e, em seguida, com uma tesoura cirúrgica, faça uma pequena incisão para expor o fígado e o diafragma. Usando a mesma tesoura, corte o diafragma e a caixa torácica e, em seguida, abra a cavidade pleural para expor o coração batendo.

Em seguida, com uma tesoura de íris, corte rapidamente o apêndice atrial direito. Uma vez observado o sangramento, insira uma agulha de calibre 30 na extremidade posterior do ventrículo esquerdo e injete lentamente 10 mililitros de PBS 1X pré-resfriado para perfundir o animal.

Para realizar laminectomia dorsal, coloque o mouse em decúbito ventral. Use um bisturi tamanho 11 para fazer duas incisões longitudinais laterais profundas, começando da região torácica até a região sacral. Em seguida, remova a pele expondo a camada muscular dorsal. Em seguida, com o Friedman-Pearson Rongeur, retire os tecidos conjuntivos e os músculos até que os processos da coluna lombossacral e os processos transversos bilaterais sejam expostos.

Primeiro, use um Friedman-Pearson Rongeur para abrir cuidadosamente a coluna vertebral dorsal. Em seguida, alterne entre uma tesoura Friedman-Pearson Rongeur e Noyes Spring para remover os ossos vertebrais, expondo a medula espinhal com os nervos espinhais intactos presos. Dissecar cuidadosamente o DRG lombar ipsilateral e contralateral.

Coloque-o em 1 mililitro de 1X HBSS sem cálcio e magnésio gelado em um homogeneizador de tecidos Dounce. Homogeneizar o tecido DRG no homogeneizador Dounce com um pilão solto por 20 a 25 vezes. Coloque um filtro de células de náilon estéril de 70 micrômetros em um tubo cônico estéril de 50 mililitros. Use 800 microlitros de 1X HBSS gelado para molhar o filtro de células.

Use uma pipeta para coletar a suspensão de tecido homogeneizado do homogeneizador no filtro de células úmidas e colete-a no tubo cônico de 50 mililitros. Enxágue o homogeneizador duas vezes com 800 microlitros de 1X HBSS gelado, coletando o líquido no mesmo tubo cônico de 50 mililitros para aumentar o rendimento.

Adicione 1,5 mililitros de gradiente de densidade isotônico gelada equilibrada em um tubo FACS de poliestireno estéril de 5 mililitros. Transfira o homogeneizado de células do tubo cônico de 50 mililitros para este tubo FACS e pipete para cima e para baixo para misturar bem.

Adicione mais 500 microlitros de 1X HBSS para selar a parte superior. Centrifugue as células a 800 vezes g por 20 minutos a 4 graus Celsius. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante que contém mielina no meio, sem perturbar o sedimento celular no fundo do tubo.

Adicione 100 microlitros de PBS contendo 5% de soro bovino fetal ao pellet e ressuspenda as células DRG. Em seguida, adicione o anticorpo CX3CR1-APC de camundongo alfa às células e incube no escuro a 4 graus Celsius por 1 hora.

Lave as células uma vez com 5 mililitros de PBS. Centrifugue as células a 360 vezes g por 8 minutos a 4 graus Celsius. Aspire o sobrenadante e, em seguida, ressuspenda o pellet celular em 300 microlitros de PBS para análise FACS.