Geração in vitro de células dendríticas plasmocitoides a partir de progenitores linfóides comuns

As células dendríticas plasmocitoides, ou pDCs, são células imunes que respondem à infecção produzindo a citocina interferon tipo I.

Para gerar pDCs in vitro, pegue uma suspensão de células progenitoras linfóides comuns, ou CLPs, isoladas da medula óssea de camundongos. Os CLPs podem se diferenciar em linfócitos e células dendríticas.

Adicione a suspensão celular sobre uma camada de células alimentadoras - células estromais aderentes - irradiadas com raios gama para inibir a proliferação. As células alimentadoras fornecem citocinas e contato célula-célula necessários para a diferenciação de CLPs.

Adicione uma concentração adequada de ligante tirosina quinase 3 semelhante a Fms, ou FL - uma citocina bivalente que promove o desenvolvimento de pDC - e incuba.

Os CLPs migram entre as células alimentadoras e proliferam para formar grupos de células, denominadas áreas de paralelepípedos.

O FL no meio se liga ao receptor Flt3 - um receptor de tirosina quinase - nos CLPs. A ligação induz a dimerização do receptor e a autofosforilação dos resíduos de tirosina no domínio citoplasmático.

As proteínas adaptadoras citoplasmáticas se ligam a esses resíduos e tornam-se fosforiladas, transduzindo o sinal para os componentes de sinalização a jusante. A cascata de sinalização causa a diferenciação de CLPs em pDCs - pequenas células redondas que crescem em suspensão - bem como células dendríticas convencionais, ou cDCs - células aderentes maiores em forma de fuso.

Colete as células. Adicione anticorpos contra marcadores de superfície específicos de pDC e cDC. Analise as células usando citometria de fluxo.

Células positivas para marcadores específicos de pDC e negativas para marcadores específicos de cDC indicam desenvolvimento bem-sucedido de pDC.

Para analisar os progenitores linfóides comuns, ou CLPs, por citometria de fluxo, em seguida, F_c bloqueia as células com anti-CD16 / 32 por um a dois minutos, seguido de coloração simultânea das células com o coquetel de anticorpos apropriado.

Após 15 minutos no gelo, lave as células em três mililitros de tampão FACS e ressuspenda o pellet em 300 microlitros de tampão FACS fresco. Em seguida, filtre a suspensão celular através de um filtro de 40 micrômetros e classifique imediatamente as células em um citômetro de fluxo usando os filtros e voltagens apropriados, coletando as células de interesse em um tubo de 15 mililitros contendo 8 mililitros de RPMI completo.

Para gerar uma população de pDC altamente enriquecida, é crucial separar a população certa de CLPs de células de medula óssea colhidas para a cultura in vitro com sistema alimentador de AC-6.

No final da classificação, gire as células e ressuspenda o pellet de célula CLP com RPMI completo suficiente para obter uma densidade celular de cerca de 5 vezes 10 elevado à 4ª células por mililitro. Em seguida, semeie 500 células por poço na placa de 12 poços contendo as células alimentadoras de AC-6 e complemente as co-culturas com 100 nanogramas por mililitro de ligante FLT3. Em seguida, incube as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono com monitoramento visual periódico da célula dendrítica, ou desenvolvimento DC, sob um microscópio.

No dia 12, colha as células no sobrenadante de co-cultura e lave cada poço uma vez com meio mililitro de meio RPMI completo, agrupando os sobrenadantes e lavagens resultantes. Em seguida, adicione meio mililitro de meio fresco a cada poço e use um raspador de células para separar as células aderentes. Combine as células destacadas com as células flutuantes e centrifugue a suspensão celular resultante, ressuspendendo o pellet em 50 microlitros de tampão FACS.

Em seguida, conte as células e comode-as para a expressão de CD11c, CD11b e B220 após o bloqueio de Fc, como acabamos de demonstrar. As células co-cultivadas podem então ser analisadas quanto à presença de populações convencionais CD11c positivas, CD11b positivas, B220 negativas e plasmocitóides CD11c positivas, CD11b negativas, B220 positivas.