Name: Farmacológica e funcional Ensaios genética para manipular Regeneração da planária Dugesia japonica /em (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Aprenda ensaios regenerativos em planárias Dugesia japonica usando manipulação farmacológica e RNAi in vivo. Este método permite estudar diferenciação de células-tronco e biologia regenerativa.

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Trabalho no laboratório é apoiado pela NSF (MCB0919933) e NIH (GM088790).

1. Tronco ensaio de regeneração do fragmento <ol><li> Parar de alimentar uma coorte de worms por pelo menos cinco dias antes do ensaio regenerativa para garantir os animais são livres de resíduos e alimentos ingeridos (~ 30 worms intactos, cada minhoca ~ 8-10 mm de comprimento pós-inanição). </li><li> No dia do ensaio, lavar um prato pré-congelado de gelo nivelado com água e cobrir a superfície plana gelada com filme plástico. Utilizando uma pinça, coloque um filtro de papel sobre o plástico. </li><li> Umedecer o papel de filtro com algumas gotas de água de nascente. Transferência de planárias em filtro (&lt;20 worms por filtro), utilizando uma pipeta. Worms pode ser reposicionada no filtro, se necessário, por repipetting com água mais primavera. Retire o excesso de fluido. </li><li> Usando um bisturi, amputar a cabeça por um único corte feito aproximadamente a meio caminho entre o ápice anterior do animal e da extremidade anterior da faringe (Figura 1A). </li><li> Usando um bisturi, amputar a região da cauda por um único corte feito aproximadamente a meio caminho entre o fim da cauda do animal e extremidade posterior da faringe (Figura 1A). Retire o excesso de muco no bisturi usando uma toalha de papel umedecido com álcool 70% após o corte. Limpe o excesso de etanol bisturi. </li><li> Transferência do filtro através de pinças em uma placa de Petri (100 x 25mm profundidade) contendo água de nascente. Espere ~ 3 minutos (para o fechamento da ferida, observável por um beliscar e escurecimento da ferida). </li><li> Enxágüe tronco a partir de fragmentos de papel de filtro para placa de Petri contendo meio desejado para o ensaio de regeneração e transferência para termostatizado incubadora (24 ° C). </li><li> Pontuação fenótipo regenerativa após ~ 1 semana, quando as estruturas regeneradas são identificáveis ​​(Figura 1A). </li></ol> 2. Manipulação farmacológica da regeneração: bipolaridade induzida por praziquantel <ol><li> Prepare estoque praziquantel (PZQ) por droga solubilização em DMSO (62.4mg PZQ em 1mL de ações 200mM). Use no mesmo dia. </li><li> Faça 50mL de drogas contendo solução (90 mM PZQ) em sais Montjuch buffered. Vortex de ~ 1 minuto para garantir a dispersão. </li><li> Realizar ensaio de tronco regenerativas fragmento como detalhado acima [protocolo n º 1], expondo uma coorte de fragmentos tronco para PZQ na etapa final [1,7]. </li><li> Após 24-48 horas, a troca PZQ contendo mídia para água mineral, lavar várias worms (&gt; 3) vezes. </li><li> Retorno worms para incubadora. Bipolaridade pontuação (dois-cabeças, Figura 1B) uma semana após o corte. </li></ol> 3. Manipulação genética de regeneração: in vivo protocolo de alimentação RNAi <ol><li> Antes do ensaio, prepare homogeneizado de fígado de galinha. Descartar graxos, amarelo seções coloridas de estoque de alimentos, e purê de fígado remanescente. Filtro de puré através da malha do filtro e suspensão alíquota para armazenamento (1,5 ml tubos, -20 ° C). </li><li> Antes do ensaio, prepare bovina glóbulos vermelhos (hemácias) por alíquotas de fornecimento em amostras de 1 mL, armazenadas a -20 ° C. </li><li> Selecione worms para RNAi. Três coortes são usados: o gene de interesse, controle positivo (gene com fenótipo RNAi conhecidos; Figura 1C, D &amp; E) e controle negativo (gene sem fenótipo RNAi, também útil para avaliação dos níveis de knockdown em relação ao grupo experimental). Para cada coorte, use ~ 250 worms (~ 8-10 mm de comprimento após passar fome durante pelo menos 5 dias). Loja em água de nascente na banheira de plástico. </li><li> Para cada RNAi estoque descongelar coorte, de E. coli expressando dsRNA gene targeting de interesse [8], juntamente com um tubo de homogenato de fígado de frango [3.1] e um tubo de hemácias [3.2]. </li><li> Pellet de bactérias (13.000 g, 1 minuto). Remover o sobrenadante e ressuspender sedimento em 2xYT media (~ 700μl). Recentrifuge, elimine o sobrenadante, coloque pellet no gelo. </li><li> Criar um grande furo P200 ponteira cortando o final da ponta. Completamente ressuspender o sedimento de bactérias em uma mistura de fígado de galinha homogenato (150 mL) e hemácias (50 mL) para criar RNAi mix de alimentação. Remover bolhas de ar por centrifugação. </li><li> Para a alimentação, retire a maior parte da água da banheira de plástico contendo worms (leave ~ profundidade de 1 polegada). Tub redemoinho de concentrar worms no centro deste recipiente e misturar a alimentação pipeta RNAi em um círculo corralling worms. Use uma pipeta com cuidado coaxial fugitivos de volta para o mix de alimentação RNAi sem perturbar outros clientes! </li><li> Após a alimentação (~ 1 hora), identificar planárias que alimentou bem. Esses vermes mostram uma coloração vermelho profundo de hemácias ingerido. Descartar outros. </li><li> Recolocá alimentação solução com água fresca, minimizando distúrbios para evitar egestion de alimentos. Para fazer isso, gentilmente localizar os worms para um lado do tubo com uma pipeta de transferência, derramar água turva, e recolocá com água fresca derramadas na parede oposta da banheira. Planárias Resubmerge mais rapidamente a exposição prolongada ao ar também resulta em egestion alimentos. </li><li> Vagamente sial tampa do recipiente e retornar à incubadora (24 ° C) </li><li> Repita RNAi protocolo de alimentação durante vários ciclos (~ 2-3 dias de intervalo), intercalados com ciclos regenerativos [protocolo # 1] para triagem de fenótipos RNAi. Um protocolo padrão de alimentação e de regeneração eficaz para muitos genes é mostrado na Figura 2, que leva ~ 1 mês de duração total. </li></ol> Modificar este esquema para genes diferentes, como protocolo ideal dependerá de fatores como a estabilidade do RNAm, a localização do tecido, perdurance proteína, ou o desenvolvimento de um fenótipo que impede os ciclos de alimentação múltiplas após a regeneração. Avaliar os níveis de knockdown simplesmente triagem para penetrância do fenótipo (se aparente), ou por abordagens qPCR comparar os níveis de mRNA alvo de grupo de controlo negativo. 4. Resultados representativos: O tronco ensaio regeneração fragmento é tão forte que todos os vermes deve regenerar normais ântero-posterior ("cabeça à cauda) polaridade. Isto pode ser marcado assim que cinco dias após o corte, facilitada pelo surgimento da eyespots anterior (asterixed, Figura 1A). No entanto, a restauração completa das estruturas morfológicas perdido ocorre após uma semana. Manipulação farmacológica da regeneração fragmento de tronco por PZQ para produzir duas cabeças worms (Figura 1B) também é robusta (EC 50 = 87 (+ -) 11% fragmentos bipolar, 70μM PZQ por 48 horas 20). Bipolaridade ocorre ao longo de um único ciclo regenerativo. Menor eficácia nestes ensaios provavelmente relacionado a problemas com a solubilidade de drogas e / ou armazenamento, ou o uso de uma espécie diferente, onde platelminto PZQ é ineficaz. De drogas com menor penetrância, um índice anteriorização é muitas vezes usado para marcar fenótipos intermediários para além de 22 bipolaridade completa. Fenótipos resultantes de RNAi de construções de controle positivos são mostrados na Figura 1: RNAi de Dugesia japonica seis-1 (D j e seis-1) resulta em um fenótipo eyeless 23 (Figura 1C), RNAi de Dugesia PC2 japonica (Dj-PC2) resulta em uma perda da resposta aversão a luz 24 (Figura 1D) e RNAi de Dugesia japonica βcatenin-1 (Dj-βcatenin-1) resulta em um fenótipo de duas cabeças 16-19, 21 a partir de fragmentos do tronco (Figura 1E). Estes fenótipos pode ser conseguido usando os seguintes protocolos de RNAi simples: Dj e seis-1 (FFxFx), Dj-PC2 (FFFx), Dj-βcatenin-1 (FFxFx), onde F = ciclo de alimentação e x = ciclo regenerativo, respectivamente. <img src="/files/ftp_upload/3058/3058fig1.jpg" alt="Figura 1"> Figura 1:... Trunk ensaio de regeneração fragmento de A Esquerda, Imagem do planária (topo) e esquema (meio) para mostrar a posição do fragmento retirado do tronco direito, timecourse de regeneração fragmento de tronco mostrando a aparência de um fragmento de regeneração, por vezes indicado (dias) B imagem de duas cabeças planária produzida pela exposição PZQ. verme C 'Eyeless "produzido pelo Dj e seis-1 RNAi. D Perda de resposta de aversão a luz no imóvel Dj-PC2 RNAi worms (manchada de vermelho), em comparação com o controle sem-fim móvel (manchada verde). E Bipolar planária produzido por Dj-βcatenin-1 RNAi. No BE, o final original anterior dos vermes RNAi é orientado para a esquerda. <img src="/files/ftp_upload/3058/3058fig2.jpg" alt="Figura 2"> Figura 2: Seqüência de ciclos de alimentação e corte de protocolo de RNAi típico composto por múltiplas refeições (F), e os ciclos de regeneração (x) que é eficaz para knockdown de muitos genes em D. japonica. Modificação do presente protocolo para genes individuais pode ser necessária para produzir os melhores resultados, por exemplo usando um arquivo. Menores (entre parênteses) ou um número maior de alimentação e ciclos de regeneração

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<li>Petersen, C. P., Reddien, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smed-betacatenin-1+is+required+for+anteroposterior+blastema+polarity+in+planarian+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Smed-betacatenin-1 is required for anteroposterior blastema polarity in planarian regeneration.</a> Science. 319, 327-330 (2008).</li>
<li>Iglesias, M., Gomez-Skarmeta, J. L., Saló, E., Adell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+of+Smed-betacatenin1+generates+radial-like+hypercephalized+planarians%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Silencing of Smed-betacatenin1 generates radial-like hypercephalized planarians.</a> Development. 135, 1215-1221 (2008).</li>
<li>Nogi, T., Zhang, D., Chan, J. D., Marchant, J. S., S, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+biological+activity+of+praziquantel+requiring+voltage-operated+Ca2%2B+channel+beta+subunits%3A+subversion+of+flatworm+regenerative+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">A novel biological activity of praziquantel requiring voltage-operated Ca2+ channel beta subunits: subversion of flatworm regenerative polarity.</a> PLoS Negl Trop Dis. 3, e464-e464 (2009).</li>
<li>Oviedo, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-range+neural+and+gap+junction+protein-mediated+cues+control+polarity+during+planarian+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Long-range neural and gap junction protein-mediated cues control polarity during planarian regeneration.</a> Dev Biol. 339, 188-199 (2010).</li>
<li>Nogi, T., Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+innexin+gene+expression+and+functional+roles+of+gap-junctional+communication+in+planarian+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of innexin gene expression and functional roles of gap-junctional communication in planarian regeneration.</a> Dev Biol. 287, 314-335 (2005).</li>
<li>Mannini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Djeyes+absent+%28Djeya%29+controls+prototypic+planarian+eye+regeneration+by+cooperating+with+the+transcription+factor+Djsix-1%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Djeyes absent (Djeya) controls prototypic planarian eye regeneration by cooperating with the transcription factor Djsix-1.</a> Dev Biol. 269, 346-359 (2004).</li>
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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Os protocolos descritos aqui detalhadamente os ensaios para o estudo e manipulação de regeneração da planária Dugesia japonica. Eles são simples e não requerem equipamento especializado de modo que possam ser facilmente realizado no laboratório ou sala de aula. Ensaios podem ser realizados individualmente ou combinados (químicos para rastreamento genético de eficácias de drogas in vivo) e pode ser realizada ao nível de genes candidatos, ou são adaptáveis ​​a throughput screening imparcial, acima de 8. Se para o estudo da biologia de planárias intrigante em seu próprio direito, ou para a avaliação in vivo em função de homólogos mamíferos em um modelo alternativo para estudar a regeneração do tecido, estas abordagens devem catalisar o interesse de uma gama diversificada de pesquisadores.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagente </th><th> Vendedor </th><th> Número Catálogo </th><th> Comentários </th></tr><tr><td> Água de nascente </td><td> Kandiyohi. Premium Waters Inc. Minneapolis, MN </td><td> n / a </td><td> Outras formas de água de nascente funcionar bem também. Primeiro julgamento em ensaios de viabilidade. </td></tr><tr><td> 1 x buffered Montjuich sais: NaCl (1,6 mm), CaCl2 (1mM), MgSO4 (1mM), MgCl2 (0,1 mM), KCl (0,1 mm), NaHCO3 (1,2 mm), HEPES (1,5 mM). pH 7,4 a 24 ° C. </td><td> Múltiplos fornecedores </td><td> n / a </td><td> Água artificial para os tratamentos com drogas durante os ensaios de regeneração para garantir buffer pH. Solução 08/05 Holtfreter é uma alternativa. </td></tr><tr><td> 2xYT Caldo </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP2467-500 </td><td> Media = 31 g / L. Autoclavado. </td></tr><tr><td> Petri Dish (100x25mm) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-757-11 </td><td> Worms habitação durante os ciclos de regeneração </td></tr><tr><td> Praça Dish (100x100x15mm) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-757-11A </td><td> Encha com água, para congelar bandeja de gelo usado como superfície de corte verme </td></tr><tr><td> Tubo de plástico: Twist Ziploc &#39;n Loc (16 onças). </td><td> Vários retalhistas </td><td> n / a </td><td> Conveniente recipientes de água apertado para coortes RNAi </td></tr><tr><td> Fígado de frango </td><td> Mantimento comercial </td><td> n / a </td><td> Viés para suprimentos orgânicos, devido à evasão de antibióticos. </td></tr><tr><td> Lado Blender </td><td> Qualquer fornecedor de cozinha </td><td> n / a </td><td> Use para fazer purê de fígado de galinha </td></tr><tr><td> Fio de 1 milímetro de malha do filtro </td><td> Qualquer fornecedor de cozinha </td><td> n / a </td><td> Use para esticar purê de fígado de galinha </td></tr><tr><td> Bovina glóbulos vermelhos </td><td> Lampire Biological Laboratories </td><td> 7240807 </td><td> 100% lavado e pooled suspensão RBC </td></tr><tr><td> Circular papéis de filtro </td><td> Whatman # 3 </td><td> 1003 055 </td><td></td></tr><tr><td> Transferência Pipetar </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-711-41 </td><td></td></tr><tr><td> Estéreis, lâminas cirúrgicas </td><td> Múltiplos fornecedores </td><td> n / a </td><td></td></tr><tr><td> ± Praziquantel </td><td> Sigma Aldrich </td><td> P4668 </td><td> Alíquotas em pó armazenar no escuro a 4 ° C. Desidratar. </td></tr><tr><td> Dj e seis-1 </td><td></td><td> GenBank AJ557022.1 </td><td> RNAi para controle positivo &quot;olho-less&quot; fenótipo 23 </td></tr><tr><td> Dj-βcatenin-1 </td><td></td><td> GenBank AB181913.1 </td><td> RNAi para controle positivo de duas cabeças fenótipo 17 </td></tr><tr><td> Dj-PC2 </td><td></td><td></td><td> RNAi controle positivo para a perda do fenótipo aversão a luz 24 </td></tr></tbody></table>

farmacológica e funcional ensaios genética para manipular regeneração da planária dugesia japonica</em

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Platelmintos de vida livre planária tem uma longa história de uso experimental, devido às suas notáveis ​​capacidades regenerativas 1. Pequenos fragmentos retirados de estes animais reformar o plano de corpo original após a regeneração das estruturas do corpo faltando. Por exemplo, se um fragmento &quot;tronco&quot; é cortado a partir de um verme intacta, &#39;cabeça&#39; de um novo vai gerar anteriormente e um &#39;rabo&#39; vai gerar posteriormente restaurar o original polaridade &quot;head-to-tail&quot; das estruturas do corpo antes da amputação (Figura 1A). Regeneração é impulsionado por células-tronco em planárias, conhecido como &quot;neoblasts &#39;que se diferenciam em ~ 30 diferentes tipos de células durante a homeostase corporal normal e regeneração de tecidos aplicadas. Este processo regenerativo é robusto e fácil de demonstrar. Devido à dedicação de vários laboratórios pioneiros, muitas ferramentas e métodos genéticos funcionais já foram otimizados para o sistema modelo. Conseqüentemente, os progressos recentes considerável tem sido feito na compreensão e manipulação dos eventos moleculares subjacentes à plasticidade do desenvolvimento planária 2-9. O sistema modelo planária serão de interesse para uma ampla gama de cientistas. Para os neurocientistas, o modelo oferece a oportunidade de estudar a regeneração de todo um sistema nervoso, ao invés de simplesmente a regeneração / reparação de processo único de células nervosas que normalmente são foco de estudo em muitos modelos estabelecidos. Planárias expressar uma infinidade de neurotransmissores 10, representam um importante sistema para o estudo da evolução do sistema nervoso central 11, 12 e têm potencial de triagem comportamental 13, 14. Regenerativa resultados são passíveis de manipulação por apparoaches farmacológicos e genéticos. Por exemplo, as drogas podem ser rastreados para efeitos sobre a regeneração simplesmente colocando fragmentos do corpo em soluções contendo droga em diferentes momentos após a amputação. O papel de genes individuais pode ser estudada usando métodos knockdown (in vivo RNAi), que pode ser conseguido através de ciclos de microinjeção ou alimentando-bacterially expressa constrói dsRNA 8, 9, 15. Ambas as abordagens podem produzir fenótipos visualmente impressionante em alta penetrância, por exemplo, regeneração de animais bipolar 16-21. Para facilitar a adoção deste modelo e implementação de tais métodos, nós apresentamos neste artigo vídeo protocolos para ensaios farmacológicos e genéticos (RNAi in vivo pela alimentação), utilizando o planária Dugesia japonica.

Um modelo atraente para estudar a diferenciação das células-tronco dentro de um animal vivo é o platelminto planária. Regeneração é estudado por experimentos amputação simples que são facilmente realizados em um laboratório básico e são passíveis de (farmacológicos e genéticos<em&gt; In vivo</em&gt; RNAi) manipulação, conforme detalhado por protocolos neste artigo.

Farmacológica e funcional Ensaios genética para manipular Regeneração da planária Dugesia japonica</em

Planárias de vida livre têm um longo histórico de utilização experimental devido às suas extraordinárias capacidades regenerativas1. Pequenos fragmentos excisados de ...

O objetivo geral dos experimentos a seguir é realizar e manipular ensaios de regeneração em planárias Parian utilizando métodos farmacológicos e/ou de silenciamento genético. O primeiro passo é dominar o ensaio básico de amputação e regeneração. Em seguida, mostra-se como drogas podem ser usadas para alterar a polaridade regenerativa, por exemplo, para gerar animais com duas cabeças.Por fim, é apresentada uma descrição de como realizar RNAi in vivo por alimentação, com o objetivo de examinar os efeitos da perda de função de genes específicos. Os resultados mostram que o tratamento com a droga quintal subverte a regeneração, produzindo vermes com duas cabeças, e que a diminuição genética de uma betaina e de uma isoforma produz um fenótipo grosseiramente semelhante.Olá, meu nome é John Chan, aluno de pós-graduação no laboratório Marching, e eu demonstrarei estes procedimentos. A demonstração visual desses métodos é importante porque, embora individualmente nenhum passo seja difícil, a demonstração geral dessas técnicas ajudará pesquisadores novos neste sistema modelo.Em preparação para o ensaio, interrompa a alimentação de um grupo de aproximadamente 30 parianos por pelo menos cinco dias após o jejum. O verme deve ter entre oito e dez milímetros de comprimento no dia do ensaio. Enxágue um recipiente de gelo pré-nivelado com água e cubra a superfície plana gelada com filme plástico usando pinças.Coloque um papel-filtro sobre o plástico. Umedeça o papel-filtro com algumas gotas de água de nascente usando uma pipeta de transferência, colocando no máximo 20 plin sobre o filtro. Se necessário, os vermes podem ser reposicionados sobre o filtro por meio de nova pipetagem com mais água de nascente.Uma vez que as minhocas estejam posicionadas, remova qualquer fluido em excesso usando um bisturi, ampute a cabeça fazendo um único corte aproximadamente na metade entre o ápice anterior do animal e a extremidade anterior da faringe. Em seguida, ampute a região da cauda fazendo um único corte aproximadamente na metade entre a extremidade posterior do animal e a extremidade posterior da faringe. Remova o muco em excesso do bisturi usando uma toalha de papel umedecida com etanol 70% após o corte, e depois limpe o etanol em excesso do bisturi antes de cortar novamente.Retire o filtro com pin&ccedil;as e transfira-o para uma placa de Petri contendo &aacute;gua de nascente. Aguarde aproximadamente tr&ecirc;s minutos para o fechamento da ferida, que &eacute; observ&aacute;vel por um estrangulamento e escurecimento da les&atilde;o. Enxague os fragmentos do tronco do papel de filtro para uma placa de Petri contendo o meio desejado para o ensaio de regenera&ccedil;&atilde;o e transfira para uma incubadora termostatizada ajustada a 24 graus Celsius.Avalie o fenótipo regenerativo após cerca de uma semana. Quando estruturas regeneradas forem identificáveis, prepare um estoque de quintal ou PZ Q a 200 milimolares solubilizando a droga em DMSO para uso fresco no mesmo dia. Em seguida, prepare 50 mililitros de solução contendo a droga adicionando 22,5 microlitros do estoque de PZ Q aos sais mágicos tamponados e vortexie por cerca de um minuto.Para garantir a dispersão, coloque os vermes sobre papel filtro umedecido com água de nascente e ampute as regiões da cabeça e da cauda conforme descrito no ensaio de regeneração por fragmentação do tronco. Após a amputação e o fechamento da ferida, transfira os fragmentos do tronco para uma placa de Petri contendo água de nascente. Substitua o meio por solução de PZ Q a 90 micromolar e transfira a placa de Petri para uma incubadora a 24 graus Celsius. Após 24 a 48 horas, substitua o meio contendo PZ Q por água de nascente, lavando o verme várias vezes, retorne os vermes à incubadora e, após uma semana, avalie o fenótipo de bipolaridade ou de dois cabeças dos vermes antes do ensaio.Prepare o homogenato de fígado de frango, descarte as seções amarelas gordurosas do estoque alimentar e, em seguida, bata o fígado restante no liquidificador. Filtre a pasta obtida através de uma peneira e armazene a suspensão aquosa. Em seguida, prepare os glóbulos vermelhos bovinos ou hemácias por Ali, dividindo o suprimento em amostras de um mililitro armazenadas a menos vinte graus Celsius.Utilize vermes que foram mantidos em jejum por cinco dias e agrupe-os em três coortes. O gene de interesse, controle positivo com fenótipo de RNAi conhecido e controle negativo. Um gene sem fenótipo de RNAi.Para cada coorte, utilize cerca de 250 vermes com comprimento entre oito e dez milímetros. Descongele um estoque de e coli para cada coorte que expresse RNA de fita dupla, visando os genes de interesse, juntamente com um tubo de fígado de frango, homogeneizado, e um tubo de hemácias. Pelote as bactérias por centrifugação a 13.000 Gs durante um minuto, remova o sobrenadante e re-suspenda o pellet em 700 microlitros de meio 2XYT.Recentrifugue, descarte o sobrenadante e coloque o pellet sobre gelo. Crie uma ponteira P-200 de grande orifício cortando completamente a ponta e, em seguida, ressuspenda completamente o pellet bacteriano em 150 microlitros de homogenato de fígado de frango mais 50 microlitros de hemácias para criar uma mistura de alimentação para RNAi. Remova as bolhas de ar por meio de uma breve centrifugação em pulso antes da alimentação.Remova a maior parte da água do recipiente plástico contendo os vermes, deixando cerca de um centímetro de profundidade. Gire o recipiente para concentrar os vermes no centro deste recipiente. Em seguida, pipete o meio de alimentação com RNAI em círculo, confinando os vermes.Use uma pipeta de transferência para, cuidadosamente, conduzir de volta para a mistura de alimentação com RNAi quaisquer indivíduos que tenham escapado, sem perturbar os demais vermes após cerca de uma hora de alimentação; identifique os parâmetros que se alimentaram bem e remova os vermes que não parecem bem alimentados. Verme bem alimentado apresenta coloração vermelho-escura proveniente dos glóbulos vermelhos ingeridos.Substitua cuidadosamente a solução de alimentação por água de nascente fresca, tomando cuidado para minimizar distúrbios a fim de evitar a ingestão de alimento. Para isso, localize suavemente os vermes em um dos lados do recipiente usando um tubo de transferência. Despeje a água suja e substitua cuidadosamente pela água fresca, despejando-a na parede oposta do recipiente, re-submergindo-os rapidamente, pois a exposição prolongada ao ar é prejudicial.Resulta também em ingestão alimentar de forma solta. Feche a tampa do recipiente e retorne os vermes ao incubador a 24 graus Celsius. Repita este protocolo de alimentação com RNAi por múltiplos ciclos intercalados com ciclos de regeneração para, por fim, triar fenótipos de RNAi.Um cronograma padrão de alimentação e regeneração eficaz para muitos genes é mostrado aqui. F representa o protocolo de alimentação e X representa o ensaio de regeneração. No total, o protocolo leva cerca de um mês e pode ser modificado para diferentes genes incluindo menos alimentações, representadas por parênteses F, ou alimentações mais frequentes, já que o protocolo ideal dependerá de fatores como estabilidade do mRNA, localização tecidual, proteína, P dur, ou o desenvolvimento de um fenótipo que impeça múltiplos ciclos de alimentação após a regeneração.Aqui estão resultados típicos do ensaio de regeneração do tronco. À esquerda, um pariano é mostrado acima de um esquema indicando os cortes de amputação. À direita, há um curso temporal da regeneração do fragmento do tronco que ocorre ao longo de sete dias, com manchas oculares aparecendo no terceiro dia.Aqui, a subversão farmacológica da regeneração de fragmentos do tronco por PZ Q.Treatment produziu vermes com duas cabeças utilizando RNAi contra o gene DJ 61. Em um protocolo de alimentação FX FX, observa-se um fenótipo ilis; a perda da resposta de aversão à luz, vista após um protocolo de alimentação FFFX, resulta em vermes imóveis com RNAi de DJ PC, corados em vermelho, em comparação com o controle móvel. Verme corado em verde com RNAi que reduziu a expressão de DJ beta catine em um.O uso de um protocolo de alimentação FXFX resulta na regeneração de uma cabeça a partir da ferida posterior. Após seguir estes procedimentos, os pesquisadores poderão direcionar genes de interesse em suas pesquisas utilizando métodos de silenciamento ou agentes farmacológicos seletivos, a fim de explorar seu papel na biologia pariana e na regeneração de tecidos.

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Research

JoVE Journal

Biology

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