Reconstituição bioquímica de receptor de esteróide • Hsp90 Complexos de Proteínas e Reativação da ligação do ligando

O objetivo geral deste procedimento é reconstituir bioquimicamente um complexo proteico de receptor de esteroides com HSB 90 e reativar a atividade de ligação de ligantes ao receptor de esteroides, o que pode ser utilizado para testar os requisitos de cofatores da HSB 90 e os efeitos da adição de compostos exógenos ao processo de reconstituição. Isso é realizado primeiramente preparando um citosol celular contendo receptores glicocorticoides funcionais. Em seguida, o RG proveniente do citosol celular é imunoabsorvido e endógeno.

A HSP 90 é dissociada. Em seguida, o heterocomplexo GR-HSP 90 é reconstituído utilizando uma fonte exógena de HSP 90 e outras proteínas de choque térmico e cofatores. Por fim, os complexos proteicos reconstituídos e a atividade de ligação ao ligante são analisados; métodos específicos, como eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS, transferência ocidental (western blotting) e ensaios de ligação de ligantes radioativos, são utilizados para demonstrar a formação do heterocomplexo GR-HSP 90 e a atividade de ligação a esteroides.

Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da chaperona molecular HSP 90, como quais co-chaperonas e co-chaperonas COS são necessárias para facilitar a atividade funcional da HSP 90. Embora este método possa fornecer informações sobre o dobramento proteico, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como o desenvolvimento de compostos líderes dependentes da HSP 90 e a análise de vias de sinalização intracelular que necessitam da HSP 90. Demonstrarão o procedimento Hannah Franklin e Nathan, dois estudantes recém-formados do meu laboratório. Para isolar o receptor de glucocorticoide funcional, ou GR, cultive células de fibroblasto de camundongo L 9 29 ou células SF nine infectadas com vírus recombinante de GR bao, que estejam na fase de crescimento exponencial. Centrifugue a suspensão celular a 5.000 Gs durante cinco minutos a quatro graus Celsius.

O pellet resultante deve ter um volume de cerca de um a cinco mililitros. Lave o pellet celular três vezes com 15 mililitros de solução salina tamponada de Hank. Prepare 1,5 volume do tampão de homogeneização contendo tampão HEM, fenilmetilsulfonil fluoreto de um milimolar ou PMSF e três comprimidos completos de inibidor de protease mini moídos usando 50 golpes de um moinho de downs.

O homogeneizador rompeu as células; realize este passo em gelo para prevenir a degradação proteica. Ultracentrifugue o homogenato a 100.000 Gs por 30 minutos a quatro graus Celsius. Aliquote o sobrenadante contendo o citosol em tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro com 500 microlitros cada e armazene a menos 20 graus Celsius.

Para preparar uma mistura contendo um anticorpo monoclonal IgG produzido contra o receptor específico GR, combine 100 microlitros de citosol de GR descongelado, 200 microlitros de tampão TEGM, 100 microlitros de uma suspensão de 20% de proteinasero ou PAS e cinco microgramas de um anticorpo monoclonal IgG anti-G, tal como bugger dois. Devido ao tamanho relativamente grande das microesferas de PAS.

Use uma ponteira de pipeta cortada P 200 para transferir o PAS da suspensão a 20% para os tubos de amostra. Coloque as amostras em uma roda rotatória vertical e incube por um mínimo de duas horas com rotação constante. Em seguida, remova as proteínas não ligadas ao pellet de PAS com anticorpo centrifugando as amostras em uma centrífuga refrigerada por um minuto.

A 10.000 G, lave o precipitado duas vezes adicionando um mililitro de tampão TEGM, vortexando e, em seguida, centrifugando. Remova a última lavagem usando uma ponteira P 200 amassada para dissociar o HSB 90 endógeno do precipitado imunológico de GR e adicione 355 microlitros de tampão TEG e 45 microlitros de cloreto de sódio cinco molar ao anticorpo. PAS precipitado previamente preparado.

Coloque as amostras em uma roda giratória vertical e incube por uma hora e meia com rotação constante. Remova as proteínas não ligadas do pellet imunológico centrifugando por um minuto a 10.000 Gs. Lave os pellets uma vez com um mililitro de tampão TEG e uma vez com um mililitro de 10 milimolar de heaps. Tamponar pH 7,4 Utilizando uma ponteira P-200 crimpada, remova a solução de lavagem, tomando cuidado para não perturbar o pellet.

Para reconstituir o complexo heteromérico GR HSB 90, adicione ao pellet uma mistura contendo 50 microlitros de uma fonte de chaperona molecular, como um lisado de reticulócito de coelho, e cinco microlitros de um sistema gerador de ATP. Este próximo passo é crítico para garantir uma mistura adequada do pellet e da solução de reconstituição. Incube as amostras em banho-maria a 30 graus Celsius por exatamente 20 minutos.

Agite os tubos a cada um ou dois minutos para perturbar suavemente o pellet e misturar a solução de reconstituição. Adicione um mililitro de tampão TEGM, vortexie e centrifugue a 10.000 Gs por um minuto. Remova o sobrenadante tendo cuidado para não perturbar o pellet.

Repita a lavagem mais duas vezes para identificar as proteínas no pellet reconstituído. Prepare as amostras para eletroforese adicionando 50 microlitros de tampão amostra SDS-PAGE contendo beta-mercaptoetanol. Vortexe as amostras e então incube por cinco minutos em banho-maria fervente ou em um bloco térmico eletrônico a 100 graus Celsius.

Centrifugue as amostras a 10.000 Gs durante um minuto. Utilize o sobrenadante dessas amostras para eletroforese em gel de SDS ou eletroforese microfluídica, seguida de western blot. O uso de uma ponteira chanfrada de P200 para carregar o sobrenadante limitará a aspiração acidental do precipitado.

O próximo passo é analisar o complexo proteico GR HSP 90 quanto à atividade de ligação ao esteroide. Usando um esteroide tritiado, comece adicionando ao pellet imunológico reconstituído 47,5 microlitros de tampão HEM e 2,5 microlitros de dexametasona tritiada a dois micromolares.

Misture suavemente o pellet, tomando cuidado para minimizar a quantidade de amostra deslocada para a parede do tubo de microcentrífuga. Incube a amostra durante a noite, sem perturbar, em gelo. Adicione um mililitro de tampão TEGM, misture suavemente e centrifugue a 10.000 ×g por um minuto.

Descarte o sobrenatante com cuidado. Ele contém o esteroide tritiado não ligado; repita por um total de três lavagens com o tampão TEGM completamente. Remova todo o sobrenatante ao final da última lavagem.

Usando uma ponteira crimpada de pipeta P 200, suspenda os pellets imunológicos lavados em 200 microlitros de tampão TEGM e transfira para 10 mililitros. Frascos de cintilação.

Adicione 4,8 mililitros de coquetel de cintilação aos frascos e vortex. Finalmente, realize a espectrometria de cintilação líquida; dados representativos de eletroforese SDS-PAGE e western blot são mostrados aqui neste gel corado com kumasi. O complexo heterodimérico endógeno GR-HSP90 é imunoabsorvido do citosol celular utilizando anticorpos anti-GR, e as proteínas individuais co-imunoabsorvidas com o GR são visualizadas e mostradas.

Aqui estão os dados de eletroforese microfluídica da Experian representando complexos heteroméricos GR HSP 90 reconstituídos. A especificidade da imunoabsorção do GR é confirmada pela substituição do anticorpo anti-GR imunoabsorvente por um anticorpo não imune, mesmo quando quantidades excessivas são utilizadas. Nenhum GR ou chaperonas moleculares são imunoprecipitados.

Da mesma forma, é possível confirmar a dissociação da HSP 90 e de outras proteínas chaperonas do GR tratado com sal por meio de western blot dos pellets imunológicos removidos e reconstituídos. A cadeia pesada do anticorpo imunoabsorvente é detectável tanto por coloração de Kumasi quanto por western blot, confirmando que pellets imunológicos de tamanho equivalente estão sendo visualizados em cada poço. Dados representativos de atividade de ligação a esteroides do GR imunoabsorvente são apresentados aqui utilizando lisado de reticulócito ou proteínas purificadas.

A atividade de ligação ao esteroide do complexo heterodimérico GR-HSP 90 reconstituído retorna tipicamente a 75 a 100% do nível de atividade de ligação ao esteroide do GR endógeno associado à HSP 90. De forma semelhante aos dados de eletroforese, um anticorpo não imune pode ser usado no lugar do anticorpo anti-GR como controle negativo e como medida da ligação não específica do esteroide tritiado. Após este procedimento, outros métodos, como a eletroforese em gel 2D, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como qual o impacto das modificações pós-traducionais da HSP 90 na reconstituição do complexo heterodimérico e na ligação ao esteroide. Ensaios de reconstituição, como os descritos aqui, permitiram aos pesquisadores explorar a significância funcional do maquinário de co-chaperonas baseado na HSP 90 e HSP 70, bem como sua montagem sequencial, utilizando o receptor de glicocorticoide como proteína modelo cliente da HSP 90.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar complexos funcionais de proteínas do receptor de glicocorticoide e HSP 90 a partir de proteínas purificadas em lisados celulares. Os passos utilizados incluem o preparo do lisado celular contendo o receptor GR, absorção imunológica do receptor, remoção por sal dos componentes proteicos endógenos e reconstituição do complexo heteromérico utilizando HSP 90 exógena, cofatores HSP 70 e co-chaperonas.