Name: Reconstituição bioquímica de receptor de esteróide • Hsp90 Complexos de Proteínas e Reativação da ligação do ligando (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: Aprenda a reconstituir bioquimicamente complexos de proteínas GR•Hsp90 e reativar a atividade de ligação de ligantes em receptores de esteroides. Este método permite investigar requisitos de cofatores e efeitos de compostos exógenos em bioquímica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health conceder GM086822, Coração Esperança Instituto Básico de Ciências prêmio, eo MJ Murdock Charitable Confiança Colégio Programa de Pesquisa em Ciências. Selecione reagentes eletroforese e software de análise de imagem foram generosamente fornecidos pela Bio-Rad.

<ol><li>Pratt, W. B., Toft, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+signaling+protein+function+and+trafficking+by+the+hsp90%2Fhsp70-based+chaperone+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Regulation of signaling protein function and trafficking by the hsp90/hsp70-based chaperone machinery.</a> Exp. Biol. Med. 228, 111-133 (2003).</li>
<li>Murphy, P. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+glucocorticoid+receptor+steroid+binding+and+trafficking+by+the+hsp90%2Fhsp70-based+chaperone+machinery%3A+implications+for+clinical+intervention%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Regulation of glucocorticoid receptor steroid binding and trafficking by the hsp90/hsp70-based chaperone machinery: implications for clinical intervention.</a> Leukemia. 19, 710-712 (2005).</li>
<li>Pratt, W. B., Morishima, Y., Osawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hsp90+chaperone+machinery+regulates+signaling+by+modulating+ligand+binding+clefts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The Hsp90 chaperone machinery regulates signaling by modulating ligand binding clefts.</a> J. Biol. Chem. 283, 22885-22889 (2008).</li>
<li>Dittmar, K. D., Hutchison, K. A., Owens-Grillo, J. K., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+the+steroid+receptor%C2%95hsp90+heterocomplex+assembly+system+of+rabbit+reticulocyte+lysate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of the steroid receptorhsp90 heterocomplex assembly system of rabbit reticulocyte lysate.</a> J. Biol. Chem. 271, 12833-12839 (1996).</li>
<li>Morishima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hsp+organizer+protein+hop+enhances+the+rate+of+but+is+not+essential+for+glucocorticoid+receptor+folding+by+the+multiprotein+Hsp90-based+chaperone+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The Hsp organizer protein hop enhances the rate of but is not essential for glucocorticoid receptor folding by the multiprotein Hsp90-based chaperone system.</a> J. Biol. Chem. 275, 6894-6900 (2000).</li>
<li>Murphy, P. J. M., Kanelakis, K. C., Galigniana, M. D., Morishima, Y., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometry%2C+abundance%2C+and+functional+significance+of+the+hsp90%2Fhsp70-based+multiprotein+chaperone+machinery+in+reticulocyte+lysate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Stoichiometry, abundance, and functional significance of the hsp90/hsp70-based multiprotein chaperone machinery in reticulocyte lysate.</a> J. Biol. Chem. 276, 30092-30098 (2001).</li>
<li>Dittmar, K. D., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+of+the+glucocorticoid+receptor+by+the+reconstituted+Hsp90-based+chaperone+machinery.+The+initial+hsp90.p60.hsp70-dependent+step+is+sufficient+for+creating+the+steroid+binding+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Folding of the glucocorticoid receptor by the reconstituted Hsp90-based chaperone machinery. The initial hsp90.p60.hsp70-dependent step is sufficient for creating the steroid binding conformation.</a> J. Biol. Chem. 272, 13047-13054 (1997).</li>
<li>Kanelakis, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+the+hsp70-binding+protein+BAG-1+on+glucocorticoid+receptor+folding+by+the+hsp90-based+chaperone+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential effects of the hsp70-binding protein BAG-1 on glucocorticoid receptor folding by the hsp90-based chaperone machinery.</a> J. Biol. Chem. 274, 34134-34140 (1999).</li>
<li>Morishima, Y., Kanelakis, K. C., Murphy, P. J. M., Shewach, D. S., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+iterative+ratcheting+of+receptor-bound+hsp70+between+its+ATP+and+ADP+conformations+during+assembly+of+glucocorticoid+receptor.hsp90+heterocomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Evidence for iterative ratcheting of receptor-bound hsp70 between its ATP and ADP conformations during assembly of glucocorticoid receptor.hsp90 heterocomplexes.</a> Biochemistry. 40, 1109-1116 (2001).</li>
<li>Murphy, P. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pifithrin-alpha+inhibits+p53+signaling+after+interaction+of+the+tumor+suppressor+protein+with+hsp90+and+its+nuclear+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Pifithrin-alpha inhibits p53 signaling after interaction of the tumor suppressor protein with hsp90 and its nuclear translocation.</a> J. Biol. Chem. 279, 30195-30201 (2004).</li>
<li>Murphy, P. J. M., Morishima, Y., Kovacs, J. J., Yao, T. P., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+dynamics+of+hsp90+action+on+the+glucocorticoid+receptor+by+acetylation%2Fdeacetylation+of+the+chaperone%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulation of the dynamics of hsp90 action on the glucocorticoid receptor by acetylation/deacetylation of the chaperone.</a> J. Biol. Chem. 280, 33792-33799 (2005).</li>
<li>Morishima, Y., Murphy, P. J. M., Li, D. P., Sanchez, E. R., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stepwise+assembly+of+a+glucocorticoid+receptor%C2%95hsp90+heterocomplex+resolves+two+sequential+ATP-dependent+events+involving+first+hsp70+and+then+hsp90+in+opening+of+the+steroid+binding+pocket%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Stepwise assembly of a glucocorticoid receptorhsp90 heterocomplex resolves two sequential ATP-dependent events involving first hsp70 and then hsp90 in opening of the steroid binding pocket.</a> J. Biol. Chem. 275, 18054-18060 (2000).</li>
<li>Pratt, W. B., Toft, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steroid+receptor+interactions+with+heat+shock+protein+and+immunophilin+chaperones%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr.+Rev%22%5BJournal%5D)">Steroid receptor interactions with heat shock protein and immunophilin chaperones.</a> Endocr. Rev. 18, 306-360 (1997).</li>
<li>Bodwell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+phosphorylated+sites+in+the+mouse+glucocorticoid+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of phosphorylated sites in the mouse glucocorticoid receptor.</a> J. Biol. Chem. 266, 7549-7555 (1991).</li>
<li>Penna, A., Cahalan, M. W. estern <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blotting+using+the+Invitrogen+NuPage+Novex+Bis+Tris+minigels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Blotting using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels.</a> J. Vis. Exp. (7), e264-e264 (2007).</li>
<li>Choo, Y. S., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Protein+Ubiquitination%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Detection of Protein Ubiquitination.</a> J. Vis. Exp. (30), e1293-e1293 (2009).</li>
<li>Murphy, P. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+mechanism+of+assembly+of+a+glucocorticoid+receptor%26bull%3BHsp70+complex+that+is+primed+for+subsequent+Hsp90-dependent+opening+of+the+steroid+binding+cleft%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Visualization and mechanism of assembly of a glucocorticoid receptor&bull;Hsp70 complex that is primed for subsequent Hsp90-dependent opening of the steroid binding cleft.</a> J. Biol. Chem. 278, 34764-34773 (2003).</li>
<li>Schrum, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-sensitivity+detection+and+quantitative+analysis+of+native+protein-protein+interactions+and+multiprotein+complexes+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+STKE%22%5BJournal%5D)">High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry.</a> Sci STKE. 389, pl2-pl2 (2007).</li>
<li>Davis, T. R., Schrum, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IP-FCM%3A+Immunoprecipitation+Detected+by+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">IP-FCM: Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry.</a> J. Vis. Exp. (46), e2066-e2066 (2010).</li>
<li>Felts, S. J., Karnitz, L. M., Toft, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functioning+of+the+Hsp90+machine+in+chaperoning+checkpoint+kinase+I+%28Chk1%29+and+the+progesterone+receptor+%28PR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stress+Chaperones%22%5BJournal%5D)">Functioning of the Hsp90 machine in chaperoning checkpoint kinase I (Chk1) and the progesterone receptor (PR).</a> Cell Stress Chaperones. 12, 353-363 (2007).</li>
<li>Cintron, N. S., Toft, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+requirements+for+Hsp40+and+Hsp70+in+the+Hsp90+chaperone+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Defining the requirements for Hsp40 and Hsp70 in the Hsp90 chaperone pathway.</a> J. Biol. Chem. 281, 26235-26244 (2006).</li>
</ol>

Selecione reagentes eletroforese e software de análise de imagem foram fornecidos pela Bio-Rad.

O ensaio descrito acima pode ser adaptado para testar uma miríade de condições que afetam as ações chaperone da máquina chaperone hsp90/hsp70-based bem como GR ligação de esteróides. É uma modificação dos métodos previamente relatado 4,8,9,17 e é projetado para tirar vantagem dos avanços recentes em tecnologia de eletroforese e ser acessível a uma comunidade mais ampla de pesquisa. Cofatores adicionais ou proteínas de interesse pode ser adicionado ao GR • hsp90 mistura reconstituição heterocomplex, descrito n...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários </th></tr><tr><td> Células de inseto Sf9 </td><td> Invitrogen </td><td></td><td> para a expressão de baculovírus recombinante GR do mouse </td></tr><tr><td> L929 células </td><td> ATCC </td><td> CRL-2173 </td><td> para valores endógenos do mouse GR citosol preparação (alternativa à expressão baculovírus) </td></tr><tr><td> Células de hibridoma FiGR </td><td> ATCC </td><td> CRL-2173 </td><td> para preparar ascite contendo anti-GR anticorpo monoclonal (alternativa ao purificada de anticorpos BuGR2) </td></tr><tr><td> Mini completa-inibidor da protease, EDTA-livre </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11836170001 </td><td></td></tr><tr><td> proteína A-Sepharose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P3391 </td><td></td></tr><tr><td> lisado de reticulócitos de coelho </td><td> Hectares verde (Oregon, WI) </td><td></td><td> fonte rica de máquinas chaperone endógena hsp90/hsp70 </td></tr><tr><td> creatinafosfoquinase </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C3755 </td><td> para ATP-Sistema de regeneração </td></tr><tr><td> fosfocreatina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7936 </td><td> para ATP-Sistema de regeneração </td></tr><tr><td> anti-GR anticorpo monoclonal (BuGR2) </td><td> Pierce / Thermo Scientific </td><td> MA1-510 </td><td> usado para GR imunoadsorção e anticorpos como primário em mata-borrão ocidental </td></tr><tr><td> anti-hsp90 anticorpo monoclonal (AC88) </td><td> Enzo Ciências da Vida </td><td> ADI-SPA-830 </td><td> utilizado como anticorpo primário no oeste blotting </td></tr><tr><td> anti-hsp70 anticorpo monoclonal (N27F3-4) </td><td> Enzo Ciências da Vida </td><td> ADI-SPA-820 </td><td> utilizado como anticorpo primário no oeste blotting </td></tr><tr><td> IgG de soro de rato </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 038K7690 </td><td> utilizado como anticorpo não imunes para o controle negativo de imunoadsorção </td></tr><tr><td> anti-IgG de rato conjugado com peroxidase </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4416 </td><td> utilizado como anticorpo secundário no oeste blotting </td></tr><tr><td> Experion sistema de eletroforese microfluídicos </td><td> Bio-Rad </td><td> 7007001 </td><td> alternativa ao convencional SDS-PAGE </td></tr><tr><td> [1,2,4,6,7 - 3 H] dexametasona </td><td> PerkinElmer </td><td> NET1192001MC </td><td> seguir as precauções de segurança </td></tr></tbody></table>

reconstituição bioquímica de receptor de esteróide • hsp90 complexos de proteínas e reativação da ligação do ligando

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Hsp90 é uma proteína chaperone essenciais e muito abundantes molecular que foi encontrado para regular a mais de 150 eucarióticas proteínas sinalizadoras, incluindo fatores de transcrição (por exemplo, receptores nucleares, p53) e proteínas quinases (por exemplo, Src, Raf, Akt cinase) envolvidas no ciclo celular, tumorigênese, apoptose e sinalização 1,2 múltiplos eucarióticas caminhos. Muitos desses &#39;cliente&#39; proteínas para hsp90, a montagem de receptores de esteróides • hsp90 complexos é o melhor definidos (Figura 1). Nós apresentamos aqui um receptor adaptável glicocorticóides (GR) ensaio de imunoprecipitação e in vitro GR • O método de reconstituição hsp90 que pode ser facilmente utilizado para investigar a atividade hsp90 eucarióticas funcional, hsp90 mediada ligante receptor esteróide vinculativo, e os requisitos de cofactor molecular acompanhante. Por exemplo, este ensaio pode ser usado para testar hsp90 requisitos cofactor e os efeitos da adição de compostos exógenos ao processo de reconstituição. O GR foi um sistema particularmente útil para estudar hsp90 porque o receptor deve ser ligado a hsp90 de ter uma ligação do ligante fenda aberta que é acessível a 3 de esteróides. GR, endógena unliganded está presente no citoplasma de células de mamíferos não covalentemente ligado a hsp90. Como encontrado no GR endógena • heterocomplex hsp90, a ligação do ligante GR fenda está aberto e capaz de esteróides vinculativo. Se hsp90 se dissocia do GR, ou se a sua função é inibida, o receptor é incapaz de ligar esteróides e requer a reconstituição do GR • heterocomplex hsp90 antes da atividade de ligação de esteróides é restaurado 4. GR pode ser immunoprecipitated do citosol da célula usando um anticorpo monoclonal, e proteínas como a hsp90 complexado ao GR podem ser analisadas por western blot. Actividade de ligação de esteróides do GR immunoprecipitated pode ser determinada incubando a immunopellet com [3 H] esteróides. Experimentos anteriores mostraram hsp90 mediada abertura da ligação do ligante GR fenda requer hsp70, um segundo chaperone molecular também essencial para a viabilidade das células eucarióticas. Atividade bioquímica de hsp90 e hsp70 são catalisadas por co-chaperone Hop proteínas, hsp40 e p23 5. A acompanhante máquinas multiprotein contendo hsp90, Hop, hsp70, hsp40 e são endogenamente presentes no citoplasma de células eucarióticas, e lisado de reticulócitos fornece um acompanhante rica fonte de proteínas 6. No método apresentado, GR é imunoadsorvido do citosol celular e despojado da máquina chaperone endógena hsp90/hsp70 usando condições sal leve. O GR-sal despojado é então incubadas com lisado de reticulócitos, ATP e K +, o que resulta na reconstituição do GR • heterocomplex hsp90 e reativação da atividade de ligação de esteróides 7. Este método pode ser utilizado para testar os efeitos de vários cofatores acompanhante, novas proteínas e inibidores experimental hsp90 ou GR, a fim de determinar a sua importância funcional no hsp90 mediada por esteróides 11/08 vinculativo.

Um<em&gt; In vitro</em&gt; Método para preparar receptor glicocorticóide funcional (GR) • hsp90 complexos de proteína purificada a partir de proteínas e lisados ​​celulares é descrito. O método utiliza de imunoadsorção recombinante GR seguido de sal de extracção e reconstituição de proteínas complexas. A importância da co-fatores e condições de buffer são discutidos, assim como as aplicações método potencial.

Reconstituição bioquímica de receptor de esteróide • Hsp90 Complexos de Proteínas e Reativação da ligação do ligando

A Hsp90 é uma proteína chaperona molecular essencial e altamente abundante que demonstrou regular mais de 150 proteínas de sinalização eucarióticas, ...

O objetivo geral deste procedimento é reconstituir bioquimicamente um complexo proteico de receptor de esteroides com HSB 90 e reativar a atividade de ligação de ligantes ao receptor de esteroides, o que pode ser utilizado para testar os requisitos de cofatores da HSB 90 e os efeitos da adição de compostos exógenos ao processo de reconstituição. Isso é realizado primeiramente preparando um citosol celular contendo receptores glicocorticoides funcionais. Em seguida, o RG proveniente do citosol celular é imunoabsorvido e endógeno.A HSP 90 é dissociada. Em seguida, o heterocomplexo GR-HSP 90 é reconstituído utilizando uma fonte exógena de HSP 90 e outras proteínas de choque térmico e cofatores. Por fim, os complexos proteicos reconstituídos e a atividade de ligação ao ligante são analisados; métodos específicos, como eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS, transferência ocidental (western blotting) e ensaios de ligação de ligantes radioativos, são utilizados para demonstrar a formação do heterocomplexo GR-HSP 90 e a atividade de ligação a esteroides.Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da chaperona molecular HSP 90, como quais co-chaperonas e co-ch

biochemical-reconstitution-steroid-receptorhsp90-protein-complexes

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Neste vídeo, descrevemos um ensaio de ligação competitiva baseado em citometria de fluxo para detectar as interações entre o CXC Chemokine Receptor 4 (CXCR4) e seu ligante natural marcado com fluorescência CXC Chemokine Ligand 12 (CXCL12), na presença de uma pequena molécula direcionada a CXCR4. A incubação de células que expressam CXCR4 com concentrações mais baixas de moléculas pequenas permite a ligação CXCR4-CXCL12 até certo ponto, que diminui progressivamente com um aumento gradual nas...

Ensaio de ligação competitiva para identificar compostos que interrompem as interações receptor-ligante

Nós geneticamente codificam o aminoácido não natural, p-azido-L-fenilalanina em várias posições orientadas nos GPCRs e mostram a versatilidade do grupo azido em diferentes aplicações. Estes incluem uma tecnologia de fotorreticulação alvo para identificar resíduos na bolsa de ligação ao ligando de um GPCR, e específica do local de modificação bioorthogonal de GPCRs com uma etiqueta de péptido epitopo ou sonda fluorescente.

Geneticamente codificados Molecular Probes para estudar G receptores acoplados à proteína

O cetoconazol se liga e antagoniza a ativação do receptor X do pregnano (PXR). Telas de alto rendimento de leveduras de mutantes PXR definem uma região única para a ligação ao cetoconazol. Este método genético baseado em levedura descobre novas interações de receptores nucleares com ligantes que se associam a locais de ligação de superfície.

Reverter levedura Sistema de dois híbridos para identificar mamíferos Receptor Nuclear Resíduos que interagem com ligantes e / ou antagonistas

Aqui, descrevemos métodos que comumente empregamos em laboratório para determinar como a natureza da interação entre o receptor de células T e os antígenos tumorais, apresentada por antígenos leucocitários humanos, governa a funcionalidade das células T; esses métodos incluem produção de proteínas, cristalografia de raios-X, biofísica e experimentos funcionais de células T.

Usando cristalografia de raios X, Biofísica, e os ensaios funcionais para determinar a célula T mecanismos que regem o reconhecimento do receptor de Câncer Antígenos

Um ensaio de fluorescência facile é apresentado para avaliar a eficiência de amino-acil-tRNA-sintetase/tRNA pares incorporando proteínas expressadas em células de mamíferos não-canônicos amino-ácidos (ncAAs). A aplicação de ncAAs estudar receptors G-proteína acoplada (GPCRs) é descrita, incluindo mapeamento de foto-reticulação de binding sites e opaco GPCR rotulagem em células vivas.

Otimizando a incorporação genética do produto químico sondas em GPCRs para mapeamento de foto-reticulação e opaco química em células de mamíferos vivas

Um procedimento é apresentado para o dobrar do domínio de ligação do ligante periplasmático dCACHE de Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3 de corpos de inclusão e a purificação para produzir quantidades de miligrama de proteína.

Método para dobrar eficiente e purificação do Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Apresentamos um método para analisar a 4-hidroxi-tamoxifeno-dependente de estrogênio receptor alfa ligand domínio dimerização actividade de ligação usando o ensaio dos mamíferos do dois-híbrido.

Detectando a actividade de dimerização de domínio ligante-ligação do Receptor de estrogênio alfa usando o ensaio dos mamíferos do dois-híbrido

Este protocolo apresenta uma técnica para sondar interações proteína-proteína usando contas doadoras ligadas à glutationa com co-acompanhantes e contas aceitadoras de TPR fundidas gst-fused e contas aceitadoras juntamente com um peptídeo derivado de Hsp90. Usamos essa técnica para rastrear pequenas moléculas para interromper as interações de interação Hsp90-FKBP51 ou Hsp90-FKBP52 e identificamos inibidores potentes e seletivos de interação Hsp90-FKBP51.

Estudos de Interações Acompanhante-Cochaperone usando ensaio homogêneo baseado em contas

Aqui nós descrevemos uma nova técnica proteômica quantitativa para a identificação de complexos de proteína em Saccharomyces cerevisiae. Neste estudo, nós utilizamos o método SILAC juntamente com purificação de afinidade seguido por espectrometria de massa para identificar com alta especificidade dos parceiros de ligação de uma proteína ER, Scs2p.

Identificação de complexos de proteínas com proteômica quantitativa em S. cerevisiae

Um protocolo curto para a coloração de proteínas com Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 em gel de poliacrilamida é descrito sem o uso de solventes orgânicos ou em ácido acético como nos procedimentos de coloração clássica com CBB.

Coloração de proteínas em géis com Coomassie G-250 sem ácido acético e Solventes Orgânicos

Aprenda a reconstituir bioquimicamente complexos de proteínas GR•Hsp90 e reativar a atividade de ligação de ligantes em receptores de esteroides. Este método permite investigar requisitos de cofatores e efeitos de compostos exógenos em bioquímica.

Reconstituição bioquímica de receptor de esteróide • Hsp90 Complexos de Proteínas e Reativação da ligação do ligando

Explorar mais vídeos