Name: Automated interação hidrofóbica Seleção coluna de cromatografia para uso na purificação de proteínas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Aprenda a selecionar colunas de cromatografia de interação hidrofóbica automatizada para purificação de proteínas recombinantes. Este método utiliza sistema de cromatografia líquida de média pressão para aumentar a reprodutibilidade.

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Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health concessão GM086822 e National Science Foundation grande pesquisa instrumentação concessão DBI-0960313. Os autores gostariam de agradecer as Dras. Jon Miyake &amp; Donna Hardy (Bio-Rad) e Jennifer Loertscher (Seattle University), pela sua competência técnica. Seleccionar reagentes de cromatografia e instrumentação suplementar foram generosamente fornecidas pelo Bio-Rad.

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</ol>

Seleccionar reagentes de cromatografia e instrumentação suplementar foram fornecidos pela Bio-Rad.

Técnicas de cromatografia líquida provaram inestimável para a preparação de proteínas altamente purificadas necessárias para a realização de 6 imunológica, bioquímica 7, e 8 estudos estruturais. Métodos de purificação HIC mais frequentemente requer a determinação empírica de um meio preferido, e estrutura de ligando, a densidade de ligando, e as propriedades da matriz do grânulo todos têm sido mostrados para impacto nos resultados cromatográficas 2, 3. Coluna automatizado de aferição é uma abordagem eficiente para a seleção de um meio de HIC para otimização subseqüente e purificação de proteínas 4. O método automatizado coluna de aferição apresentados podem ser prontamente adaptado para várias estratégias de purificação de proteínas HIC. Alterações na concentração de sal, a escolha do sal, gradiente de sal, e pH pode melhorar ainda mais as condições de purificação, e os efeitos da variação destes parâmetros essenciais foram previamente analisado 13,14. Eluato de HIC contendo uma prote alvo parcialmente purificadain pode ser adicionalmente purificado utilizando uma técnica cromatográfica complementar, tal como cromatografia de permuta iónica (IEX) ou de exclusão em gel de filtração / tamanho cromatografia 9,10. Devido à sua absorvância de luz original e características de emissão, o perfil de eluição de GFP podem ser identificados utilizando, em linha e pós-run abordagens. Para esse efeito, este protocolo pode ainda ser adaptada para a purificação de recombinantes GFP de fusão de proteínas, em que uma proteína-alvo não relacionado é &quot;marcado&quot; com GFP. Proteínas alvo GFP pode ser detectada com luz UV 11 e purificado utilizando várias abordagens cromatográficas, incluindo a estratégia de purificação HIC descrito acima. Purificação GFP também se tornou um marco pedagógico nos laboratórios de bioquímica para o ensino de técnicas de proteína ciência moderna 12. Enquanto a purificação da proteína básica de HIC pode ser conduzida usando uma substancialmente menos robusto cromatografia syhaste, a instrumentação aqui apresentado tem um número de vantagens distintas para auxiliar na obtenção de resultados favoráveis. Benefícios notáveis ​​de se utilizar um sistema altamente automatizado incluem a melhoria executar-a-correr condição de reprodutibilidade, tempo de poupança, e diminuiu oportunidades para o ar a ser introduzidos no sistema 10. Sistema controlado mistura de tampão, o que é facilitado pela maximizer sistema, permite a consistência aumentou na preparação de tampão e reprodutibilidade experimental. Desenho carga de amostra suficiente para a ansa de amostragem dinâmico para todos aferição é executado assegura ainda mais a uniformidade da amostra a ser adicionado a cada coluna e permite que para execuções sequenciais sem interrupção ou manual de recarga. Injecção da amostra controlado a partir do circuito de amostra na coluna diminui variabilidade que pode ocorrer com carregamento manual da amostra. Um par de válvulas de selecção de coluna permitir para execuções de amostra consecutivos, cada um utilizando uma coluna HIC diferente, sem ter de replumb o sistema. Executando mul<html> ti-comprimento de onda de análise é particularmente benéfico quando se examina uma proteína com um perfil único espectrofotométrico. Além disso a GFP, citocromos, flavoproteínas, e outros heme contendo proteínas podem beneficiar deste técnica. Dispositivos de monitorização de condutividade e pH permitir a verificação de tempo real condições experimentais. Dividir recolha eluato fracção permite a manipulação fracção melhorada e permite a transferência fácil para os métodos de pós-executar a análise que requerem um mínimo volume de amostra (por exemplo, ELISA, SDS-PAGE, Western blot, e Experion electroforese microfluídico). Ao operar off-line segundo coletor fração requer sincronização manual, que permite a máxima flexibilidade na seleção de coletores de fração. As desvantagens mais significativas para a utilização como um sistema de cromatografia robusto para a coluna HIC aferição e purificação de proteínas incluem o tempo inicial e as despesas orçamentais associados à aquisição de instrumentos e treinamento do operador. t &quot;&gt; O protocolo apresentado aqui utiliza um Bio-Rad DuoFlow sistema de cromatografia;. no entanto, a instrumentação igualmente robusta de outros fabricantes, tais como o Avant Akta da GE Healthcare, podem também ser utilizados e são capazes de produzir resultados equivalentes sistema de cromatografia Mesmo comparável têm características únicas de programação (por exemplo, limitações, método de nomenclatura de componentes, a preferência do operador, e escalabilidade) que devem ser considerados antes de iniciar um processo de purificação ou aquisição de instrumentos.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> <a href="http://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=223301" target="_blank">BioLogic DuoFlow Pathfinder 20 Sistema</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=223301" target="_blank">7602257</a> </td><td> Inclui sistema maximizador, mixer, estação de trabalho F10, AVR7-3 da válvula, QuadTec UV / Vis detector com célula de fluxo, coletor de fração BioFrac, software BioLogic, e kit de iniciação </td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=760-0408&vertical=LSR&parentCategoryGUID=22c495f1-36ff-44a3-9140-ee7e54d0b1ba" target="_blank">AVR9-8-stream selecionar válvula</a><html></td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=760-0408&vertical=LSR&parentCategoryGUID=22c495f1-36ff-44a3-9140-ee7e54d0b1ba" target="_blank">7600408</a> </td><td> De alta pressão da válvula, 9-porta, posição 8, 3.500 psi (233 bar) limite, para uso com o sistema DuoFlow BioLogic </td></tr><tr><td> Desviador válvula SV3T-2 </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td> 7600410 </td><td> Válvula de solenóide, 3-porta, posição 2, 30 psi (2 bar) limite, para uso com o sistema DuoFlow BioLogic </td></tr><tr><td> Stream Splitter válvula </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td></td><td></td></tr><tr><td>tical = LSR &amp; parentCategoryGUID = 22c495f1-36ff-44a3-9140-ee7e54d0b1ba &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; DynaLoop 25 Kit </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=750-0451&vertical=LSR&parentCategoryGUID=22c495f1-36ff-44a3-9140-ee7e54d0b1ba" target="_blank">7500451</a> </td><td> Sliding pistão kit de amostragem, inclui 25 ml de deslizamento DynaLoop laço pistão, DynaLoop partes kit (# 750-0450) </td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/LSR/PDP/ec82e7b4-919e-428b-ac03-9adf1f50a48e/BioFractrade_Fraction_Collector" target="_blank">Coletor de Frações BioFrac</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/LSR/PDP/ec82e7b4-919e-428b-ac03-9adf1f50a48e/BioFractrade_Fraction_Collector" target="_blank">7410002</a> </td><td> Dois col fração<html> leitores utilizado </td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=741-0088&vertical=LSR&parentCategoryGUID=ec82e7b4-919e-428b-ac03-9adf1f50a48e" target="_blank">BioFrac microplaca adaptador cabeça queda</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=741-0088&vertical=LSR&parentCategoryGUID=ec82e7b4-919e-428b-ac03-9adf1f50a48e" target="_blank">7410088</a> </td><td></td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&vertical=LSR&country=US&lang=en&productID=741-0017" target="_blank">BioFrac adaptador placa de microtitulação</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td>&amp; Country = EUA &amp; lang = pt &amp; ProductID = 741-0017 &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; 7410017 </td><td></td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=750-0202&vertical=LSR&parentCategoryGUID=c140016b-1958-4a91-be4c-8645a4c8204f" target="_blank">Optics UV Módulo</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=750-0202&vertical=LSR&parentCategoryGUID=c140016b-1958-4a91-be4c-8645a4c8204f" target="_blank">7500202</a> </td><td></td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=760-1331&vertical=LSR&parentCategoryGUID=c4095dc1-9260-4431-b066-823b050048c8" target="_blank">Lâmpada halógena</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td> &lt;<html> um target = &quot;_blank&quot;&gt; 7601331 </td><td></td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=220901" target="_blank">Econo Bomba Gradiente</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=220901" target="_blank">7319001</a> </td><td> bomba de gradiente de baixa pressão purificação de proteínas, inclui tubagem e kit de acessórios </td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=224301" target="_blank">Experion Sistema</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td>bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad? cmd = BRCatgProductDetail &amp; ProductID = 224301 &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; 7007001 </td><td></td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=224101" target="_blank">Experion Kit Análise Pro260</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=224101" target="_blank">7007102</a> </td><td></td></tr><tr><td> HiTrap kit seleção HIC coluna </td><td> GE Healthcare </td><td> 28-4110-07 </td><td> Inclui 7 x 1 ml pré-embalados colunas de mídia HIC para aferição </td></tr><tr><td> GE Healthcare para a Bio-Rad acessórios coluna </td><td> GE Healthcare </td><td> 18111251 e 18111257 </td><td></td></tr></tbody></table>

automated interação hidrofóbica seleção coluna de cromatografia para uso na purificação de proteínas

Automated Hydrophobic Interaction Chromatography Column Selection for Use in Protein Purification

Em contraste com outros métodos cromatográficos para proteínas de purificação (por exemplo, filtração em gel, afinidade e de troca iónica), cromatografia de interacção hidrofóbica (HIC) comumente requer determinação experimental (referido como triagem ou &quot;scouting&quot;), a fim de seleccionar o meio mais adequado para cromatografia para a purificação de uma dada proteína 1. O método aqui apresentado descreve uma abordagem automatizada para aferição para um meio óptimas HIC a serem utilizados na purificação de proteínas. HIC separa proteínas e outras biomoléculas a partir de um lisado bruto com base nas diferenças de hidrofobicidade. Semelhante a cromatografia de afinidade (AC) e cromatografia de permuta iónica (IEX), HIC é capaz de se concentrar a proteína de interesse à medida que progride através do processo cromatográfico. Proteínas mais adequados para a purificação por HIC incluem aqueles com regiões superfície hidrofóbica e capaz de suportar a exposição a concentrações de sal em excesso de 2 ammo Mtitânio sulfato de ((NH4) 2 SO 4). HIC é muitas vezes escolhido como um método de purificação para proteínas que faltam um marcador de afinidade e, portanto, inadequado para AC, e quando IEX não fornecer purificação adequada. Porções hidrofóbicas na superfície da proteína temporariamente se ligar a um ligando não polar acoplado a uma matriz inerte, imóvel. A interacção entre a proteína e do ligando são altamente dependente da concentração de sal do tampão que flui através da coluna de cromatografia, com altas concentrações iónicas reforçar a interacção proteína-ligando e tornando a proteína imóvel (isto é, ligado no interior da coluna) 2. Como diminuir as concentrações de sal, a interacção proteína-ligando dissipa, a proteína torna-se novamente móvel e elui da coluna. Vários meios HIC estão disponíveis comercialmente em pré-embalados colunas, cada uma contendo de vários ligandos hidrofóbicos (por exemplo, S-butilo, butilo, octilo, e fenil) reticulado em diferentes densidades de esferas de agarose de uma especificaçãodiâmetro ific 3. Coluna Automated aferição permite uma abordagem eficiente para determinar que a mídia HIC deve ser empregada para o futuro, experimentos de otimização mais exaustivos e purificação de proteínas é executado 4. A proteína específica a ser purificado é aqui recombinante da proteína verde fluorescente (GFP), no entanto, a abordagem pode ser adaptado para a purificação de outras proteínas com uma ou mais regiões superfície hidrofóbica. GFP serve como um modelo útil proteína, devido à sua estabilidade, único pico de absorvância de luz a 397 nm, e de fluorescência quando exposta à luz UV 5. Lisado bacteriano contendo GFP do tipo selvagem foi preparado de um tampão de elevado teor de sal, carregado num meio DuoFlow Bio-Rad a pressão do sistema de cromatografia líquida, e adsorvido a colunas HiTrap HIC contendo diferentes meios HIC. A proteína foi eluída das colunas e analisadas por in-line e métodos de pós-run de detecção. Mistura de buffer, a injeção de ciclo dinâmico amostra, col seqüencialUMN selecção, multi-comprimento de onda, análise e de divisão de recolha eluato fracção aumentou a funcionalidade do sistema ea reprodutibilidade da abordagem experimental.

Um método automático para a identificação de interacção hidrofóbica adequados cromatografia (HIC) meios de comunicação para ser utilizados no processo de purificação de proteínas é apresentada. O método utiliza um meio de pressão-sistema de cromatografia líquida incluindo mistura de tampão automatizado, injecção lacete dinâmica amostra, a selecção de coluna sequencial, multi-comprimento de onda de análise, e recolha de divisão eluato fracção.

Automated interação hidrofóbica Seleção coluna de cromatografia para uso na purificação de proteínas

Em contraste com outros métodos cromatográficos para a purificação de proteínas (ex.: filtração em gel, afinidade e troca iônica), a interação hidrofóbica...

O objetivo geral deste procedimento é selecionar uma coluna de cromatografia líquida HI ideal utilizando um método automatizado de exploração para a purificação de uma proteína recombinante com um sistema de cromatografia líquida de média pressão BioRad DUO flow. Isso é realizado primeiramente preparando os tampões necessários e lisados bacterianos contendo a proteína recombinante de interesse. Em seguida, o sistema de cromatografia duo flow é montado fisicamente, conectado hidraulicamente e preparado para o protocolo de exploração.Em seguida, as amostras são carregadas e o método programado de varredura de coluna HI é executado para coletar a fração da amostra eit. Por fim, a EIT é analisada e a coluna HI e o meio ideais são identificados com base nas características de separação observadas. Em última instância, podem ser obtidos resultados que indicam um meio de coluna HI preferencial para a purificação em larga escala da proteína de interesse do pesquisador por meio de cromatografia líquida de média pressão, utilizando as capacidades automatizadas de varredura de coluna HI do DUO flow.A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como corridas sequenciais de cromatografia em coluna manual, é que a automação do processo reduz a variabilidade e garante resultados altamente reprodutíveis. Geralmente, indivíduos novos neste método podem ter dificuldades devido à complexidade física dos sistemas modernos de cromatografia líquida. No entanto, isso pode ser facilmente dominado.Após prática suficiente, a demonstração do procedimento será realizada por Orange Stone e Shelly Anderson, dois alunos do meu laboratório. Para começar, prepare 500 mililitros dos seguintes tampões: 200 milimolar de fosfato de sódio para o tampão A1, 200 milimolar de fosfato de hidrogênio de sódio para o tampão A2 e sulfato de amônio 4,8 molar. Para o tampão B2, água desionizada atuará como tampão B1; desgaseifique os tampões para garantir condições ótimas de operação cromatográfica. O sistema maximizador misturará os tampões A1 e A2 para gerar um tampão de eluição fosfato de baixa salinidade, e misturará os tampões B1 e B2 para gerar o sulfato de amônio de alta salinidade.Tampão inicial. Prepare 20 mililitros da amostra a ser carregada, misturando 10 mililitros do lisado celular contendo a proteína a ser purificada com 10 mililitros do tampão B dois. A concentração final de sulfato de amônio da solução da amostra de lisado celular deve ser aproximadamente 2,4 molar, tornando-a aproximadamente equivalente ao tampão inicial.Filtre a mistura do tampão de lisado através de um filtro de seringa de baixa ligação a proteínas de 0,45 micrômetro para remover partículas em suspensão da solução. Mantenha a amostra em gelo até que esteja pronta para ser carregada no sistema. A montagem física e a tubulação do sistema de cromatografia são um dos aspectos mais complicados deste procedimento.Configure o sistema de cromatografia de fluxo duplo de acordo com o diagrama mostrado aqui. Certifique-se de que há volumes adequados de tampão disponíveis para todo o protocolo e de que as tubulações permanecerão continuamente submersas. Monte a válvula de carregamento da amostra e o loop de amostra dinâmico conforme ilustrado aqui, conectando o loop de amostra à entrada da válvula de amostra na posição três.Prepare oito pares de tubos de pico com diâmetro externo de um dezesseis avos de polegada, todos de tamanho idêntico. Em seguida, conecte os pares às posições de um a oito das duas válvulas de seleção de coluna. Após ligar as lâmpadas do detector de UV e confirmar que todos os detectores estão calibrados, conecte a válvula divisor de fluxo do coletor de frações e o controlador divisor conforme ilustrado aqui.O divisor de válvula do coletor de frações na posição dois e o controlador do divisor são operados fora da estação de cromatografia. Defina a porcentagem de divisão para 10. Substitua o cabeçote de gotas padrão do coletor de frações na posição dois por um cabeçote de microplaca.Enxágue o loop de amostra e limpe o sistema de cromatografia. Em seguida, inicie um fluxo manual de um mililitro por minuto de tampão de eluição através do sistema. Conecte colunas HI de alto trapa (1 mL) às posições de dois a oito das válvulas de seleção de coluna.Remova a conexão que une as válvulas de seleção de coluna da posição dois. Fixe os adaptadores da coluna a montante ao fluxo duplo. Passe o tampão eluciano pelos adaptadores até que todo o ar seja expulso e uma grande gota de tampão esteja presente.Em seguida, remova a rolha conectada à entrada da coluna e coloque uma grande gota de tampão de baixa salinidade no topo da coluna. Depois, conecte a coluna aos encaixes superiores. Conecte a saída aos encaixes da coluna inferiores e à tubulação da válvula de seleção.Defina o limite de pressão de retorno como 40 PS.I. Lave a coluna com cinco volumes de coluna do tampão Evolution a uma taxa de fluxo de um mililitro por minuto. Lave a coluna com 10 volumes de coluna do tampão inicial a uma taxa de fluxo de um mililitro por minuto.Uma vez que as leituras UV de pH e a pressão de retorno tenham estabilizado, mude manualmente as válvulas de seleção da coluna para a posição um e interrompa o fluxo do tampão. Para carregar uma amostra, submerja a tubulação de entrada da amostra no volume de 20 mililitros da amostra. Em seguida, mude a válvula de lavagem do loop de amostra para a posição um e a válvula de carregamento da amostra para purga.Inicie a ação da bomba de carregamento do loop de amostra, aspirando a amostra para dentro da tubulação da bomba a uma taxa de fluxo de um mililitro por minuto até imediatamente após a amostra atingir a válvula de carregamento da amostra. Altere a válvula de carregamento da amostra de purgação para carregamento. Reinicie a bomba de carregamento do loop de amostra a uma taxa de fluxo de um mililitro por minuto até que 10 mililitros de amostra tenham sido aspirados para dentro do loop de amostragem dinâmico a partir da janela de configuração do software biológico.Selecione os dispositivos do sistema marcados com um asterisco nesta tabela. Em seguida, selecione seis colunas de CIC para o programa de ensaio. Um gradiente linear descendente de sal e um método exploratório de seis colunas iniciam manualmente o fluxo do tampão inicial a um mililitro por minuto.Pressione iniciar no controlador do divisor para começar imediatamente a divisão do fluxo de 90% para 10%EIT logo após iniciar a execução do método do programa; pressione iniciar no painel de controle na tela do coletor de frações offline de placa de 96 poços. Observe a exibição em tempo real para confirmar os parâmetros previstos do experimento. Compare o traçado de absorvância específico para GFP em 397 nanômetros com o traçado de absorvância em 280 nanômetros para proteína geral, a fim de estimar a separação e purificação relativas usando os diferentes meios HI testados. Alíquotas de cinco a 50 microlitros das frações da placa de 96 poços podem ser transferidas para uma placa nova e analisadas quanto ao teor específico de proteína por ELISA ou Western blot, e quanto ao teor total de proteína utilizando SDS-PAGE ou um sistema de eletroforese microfluídica Experion. A condutividade representativa do gradiente salino e a pressão na coluna dos experimentos de prospecção são mostradas aqui.A alteração na concentração de sal, medida pelo percentual de tampão proveniente das linhas de tampão de alta salinidade, é típica da metodologia HI. À medida que a concentração de sal diminui, as proteínas ligadas à coluna são eluídas; a condutividade, que corresponde à concentração de sal observada, é medida em linha imediatamente após os detectores quad tech e UV. O deslocamento entre o gradiente de sal e os traçados de condutividade indica o tempo necessário para que o tampão percorra desde a entrada do tampão até o monitor de condutividade, passando pelo sistema.Durante toda a execução da amostra, a pressão do sistema e o pH permanecem relativamente constantes. Esta figura mostra cromatogramas de corridas sequenciais de exploração em coluna HI com detecção em linha de proteína total. A NGFP é realizada medindo a absorbância da luz em 280 nanômetros e 397 nanômetros, respectivamente.É possível estimar a abundância relativa e a separação da GFP para cada corrida de reconhecimento. Ao comparar as duas linhas nesta figura, tubos de cultura das frações 10, 12, 14, 16 e 18 da corrida de reconhecimento de FF de funcho foram visualizados sob luz ambiente ou fluorescente e sob luz ultravioleta; os tubos foram observados tanto de frente quanto de cima, a fim de verificar o espectro característico de emissão da GFP, que é claramente detectada na fração 14. Em ambas as imagens sob UV, o azul difuso no painel esquerdo corresponde à luz emitida pela lâmpada de UV.Esses dados pós-execução correspondem bem à detecção em linha de GFP mediante a medição da absorbância do eluato em 397 nanômetros, o que também identifica a fração 14 como contendo o pico principal da GFP aludida. Após este procedimento, outros métodos como eletroforese em gel com transferência para membrana (western blot), ELISA, microscopia de força atômica e ensaios de reconstrução bioquímica podem ser realizados para responder perguntas adicionais relacionadas à pureza e à atividade funcional da proteína em purificação.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar da necessidade de controle manual do sistema de fluxo duplo em diversos pontos do método. Exemplos incluem o reabastecimento de tampão e a carga da amostra, verificação de bolhas de ar e a ativação e desativação das lâmpadas de detecção conforme necessário. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como utilizar um sistema de cromatografia líquida para realizar a busca automatizada de colunas e meios HI ideais.A análise avaliada em linha e em formato pôster permitirá que um pesquisador selecione uma coluna adequada para a purificação em escala ampliada, a qual também pode ser combinada com outros métodos cromatográficos para aumentar a pureza e o rendimento da proteína-alvo.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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Purificação de proteínas baseada em cromatografia de troca aniônica: uma técnica de separação para isolar uma proteína de interesse do lisado bacteriano dialisado com base na carga líquida

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Este vídeo demonstra a caracterização baseada em cromatografia líquida de interação hidrofóbica de conjugados anticorpo-medicamento. Usando uma coluna de cromatografia baseada em ligante butílico, os conjugados anticorpo-medicamento são caracterizados por meio de interações hidrofóbicas com o ligante.

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Este vídeo mostra a purificação de nanopartículas de proteínas automontadas marcadas com histidina ou SAPNs usando cromatografia líquida de afinidade. As frações SAPN purificadas resultantes são adequadas para o desenvolvimento de vacinas, prometendo potenciais aplicações imunoterapêuticas.

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