Automated interação hidrofóbica Seleção coluna de cromatografia para uso na purificação de proteínas

O objetivo geral deste procedimento é selecionar uma coluna de cromatografia líquida HI ideal utilizando um método automatizado de exploração para a purificação de uma proteína recombinante com um sistema de cromatografia líquida de média pressão BioRad DUO flow. Isso é realizado primeiramente preparando os tampões necessários e lisados bacterianos contendo a proteína recombinante de interesse. Em seguida, o sistema de cromatografia duo flow é montado fisicamente, conectado hidraulicamente e preparado para o protocolo de exploração.

Em seguida, as amostras são carregadas e o método programado de exploração de coluna HI é executado para coletar a amostra fracionada eit. Por fim, o EIT é analisado e a coluna HI e o meio ótimos são identificados com base nas características de separação observadas. Em última instância, podem ser obtidos resultados que indicam um meio de coluna HI preferencial para a purificação em larga escala da proteína de interesse do pesquisador por meio de cromatografia líquida de média pressão, utilizando as capacidades automatizadas de exploração de coluna HI do sistema DUO flow.

A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como corridas sequenciais de cromatografia em coluna manual, é que a automação do processo reduz a variabilidade e garante resultados altamente reprodutíveis. Geralmente, indivíduos novos neste método podem ter dificuldades devido à complexidade física dos sistemas modernos de cromatografia líquida. No entanto, isso pode ser facilmente dominado.

Após prática suficiente, a demonstração do procedimento será realizada por Orange Stone e Shelly Anderson, dois alunos do meu laboratório. Para começar, prepare 500 mililitros dos seguintes tampões: 200 milimolar de fosfato de sódio para o tampão A um, 200 milimolar de fosfato de hidrogênio de sódio para o tampão A dois e 4,8 molar de sulfato de amônio. Para o tampão B dois, água desionizada atuará como tampão B um; desgaseifique os tampões para garantir condições ótimas de operação cromatográfica. O maximizador do sistema misturará os tampões A um e A dois para gerar um tampão de eluição fosfato de baixa salinidade, e misturará os tampões B um e B dois para gerar o sulfato de amônio de alta salinidade.

Tampão inicial. Prepare 20 mililitros da amostra a ser carregada, misturando 10 mililitros do lisado celular contendo a proteína a ser purificada com 10 mililitros do tampão B dois. A concentração final de sulfato de amônio da solução da amostra de lisado celular deve ser aproximadamente 2,4 molar, tornando-a aproximadamente equivalente ao tampão inicial.

Filtre a mistura do tampão de lisado através de um filtro de seringa de baixa ligação a proteínas de 0,45 micrômetros para remover partículas em suspensão da solução. Mantenha a amostra em gelo até que esteja pronta para ser carregada no sistema. A montagem física e a tubulação do sistema de cromatografia são um dos aspectos mais complexos deste procedimento.

Configure o sistema de cromatografia de fluxo duplo de acordo com o diagrama mostrado aqui. Certifique-se de que haja volumes adequados de tampão disponíveis para todo o protocolo e de que as tubulações permaneçam submersas. Monte a válvula de carregamento da amostra e o loop de amostra dinâmico conforme ilustrado aqui, conectando o loop de amostra à entrada da válvula de amostra na posição três.

Prepare oito pares de tubos de pico com diâmetro externo de um dezesseis avos de polegada, todos de tamanho idêntico. Em seguida, conecte os pares às posições de um a oito das duas válvulas de seleção de coluna. Após ligar as lâmpadas do detector de UV e confirmar que todos os detectores estão calibrados, conecte a válvula divisoradora de fluxo do coletor de frações e o controlador divisor conforme ilustrado aqui.

O divisor de válvula do coletor de frações na posição dois e o controlador do divisor são operados fora da estação de cromatografia. Ajuste a porcentagem de divisão para 10. Substitua o cabeçote de gotejamento padrão do coletor de frações na posição dois por um cabeçote de microplaca.

Enxágue o loop de amostra e limpe o sistema de cromatografia. Em seguida, inicie um fluxo manual de um mililitro por minuto de tampão de eluição através do sistema. Conecte colunas HI de alto trapa (1 mL) nas posições de dois a oito das válvulas de seleção de coluna.

Remova a conexão que une as válvulas de seleção de coluna da posição dois. Fixe os adaptadores da coluna de entrada ao fluxo duplo. Passe o tampão eluciano pelos adaptadores até que todo o ar seja expulso e uma grande gota de tampão esteja presente.

Em seguida, remova a rolha conectada à entrada da coluna e coloque uma grande gota de tampão de baixa salinidade no topo da coluna. Depois, conecte a coluna aos encaixes superiores. Conecte a saída aos encaixes da coluna inferiores e à tubulação da válvula de seleção.

Defina o limite de pressão de retorno como 40 PS.I lave a coluna com cinco volumes de coluna. Tampão Evolution a uma vazão de um mililitro por minuto. Lave a coluna com 10 volumes de coluna do tampão inicial a uma vazão de um mililitro por minuto.

Uma vez que as leituras UV de pH e a pressão de retorno tenham estabilizado, mude manualmente as válvulas de seleção da coluna para a posição um e interrompa o fluxo do tampão. Para carregar uma amostra, submerja a tubulação de entrada da amostra no volume de 20 mililitros da amostra. Em seguida, mude a válvula de lavagem do loop de amostra para a posição um e a válvula de carregamento da amostra para purga.

Inicie a ação da bomba de carregamento do loop de amostra, aspirando a amostra para dentro da tubulação da bomba a uma taxa de fluxo de um mililitro por minuto até imediatamente após a amostra atingir a válvula de carregamento da amostra. Altere a válvula de carregamento da amostra de purgação para carregamento. Reinicie a bomba de carregamento do loop de amostra a uma taxa de fluxo de um mililitro por minuto até que 10 mililitros de amostra tenham sido aspirados para dentro do loop de amostra dinâmico a partir da janela de configuração do software biológico.

Selecione os dispositivos do sistema marcados com um asterisco nesta tabela. Em seguida, selecione seis colunas de CIC para o programa de ensaio. Um gradiente linear descendente de sal e um método exploratório de seis colunas iniciam manualmente o fluxo do tampão inicial a um mililitro por minuto.

Pressione iniciar no controlador do divisor para começar imediatamente a divisão do fluxo em 90% para 10% EIT logo após iniciar a execução do método do programa; pressione iniciar no painel de controle na tela do coletor de frações offline de placa de 96 poços. Observe a exibição em tempo real para confirmar os parâmetros previstos do experimento. Compare o traçado de absorvância específico para GFP em 397 nanômetros com o traçado de absorvância em 280 nanômetros para proteína geral para estimar a separação e purificação relativas usando os diferentes meios HI testados. Alíquotas de cinco a 50 microlitros das frações da placa de 96 poços podem ser transferidas para uma placa nova e analisadas quanto ao teor específico de proteína por ELISA ou Western blot, e quanto ao teor total de proteína utilizando SDS-PAGE ou um sistema de eletroforese microfluídica Experian. A condutividade representativa do gradiente salino e a pressão na coluna dos experimentos de prospecção são mostradas aqui.

A alteração na concentração de sal, medida pelo percentual de tampão retirado das linhas de tampão com alta concentração salina, é típica da metodologia HI. À medida que a concentração de sal diminui, as proteínas ligadas à coluna são eluídas; a condutividade, que corresponde à concentração de sal observada, é medida em linha imediatamente após os detectores quad tech e UV. O deslocamento entre o gradiente de sal e os traçados de condutividade indica o tempo necessário para que o tampão percorra desde a entrada do tampão através do sistema até o monitor de condutividade.

Durante toda a execução da amostra, a pressão do sistema e o pH permanecem relativamente constantes. Esta figura mostra cromatogramas de corridas sequenciais de exploração em coluna HI com detecção em linha de proteína total. A NGFP é realizada medindo a absorbância da luz em 280 nanômetros e 397 nanômetros, respectivamente.

É possível estimar a abundância relativa e a separação da GFP para cada corrida de reconhecimento. Ao comparar as duas linhas nesta figura, tubos de cultura com as frações 10, 12, 14, 16 e 18 da corrida de reconhecimento do FF de funcho foram visualizados sob luz ambiente ou fluorescente e sob luz ultravioleta; os tubos foram observados tanto de frente quanto de cima, a fim de verificar o espectro característico de emissão da GFP, que é claramente detectada na fração 14. Em ambas as imagens sob UV, o azul difuso no painel esquerdo corresponde à luz emitida pela lâmpada de UV.

Esses dados pós-execução correspondem bem à detecção em linha de GFP mediante a medição da absorbância do eluato em 397 nanômetros, o que também identifica a fração 14 como contendo o pico principal da GFP aludida. Após este procedimento, outros métodos como blotagem ocidental, ELISA, microscopia de força atômica e ensaios de reconstrução bioquímica podem ser realizados para responder perguntas adicionais relacionadas à pureza e atividade funcional da proteína em purificação.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar da necessidade de controle manual do sistema de fluxo duplo em diversos pontos do método. Exemplos incluem o reabastecimento de tampão e a carga da amostra, verificação de bolhas de ar e a ativação e desativação das lâmpadas de detecção conforme necessário. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como utilizar um sistema de cromatografia líquida para realizar a prospecção automatizada de colunas e meios HI ideais.

A análise avaliada em linha e em formato pôster permitirá que um pesquisador selecione uma coluna adequada para a purificação em escala ampliada, a qual também pode ser combinada com outros métodos cromatográficos para aumentar a pureza e o rendimento da proteína-alvo.