Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Imunologia
0 visualizações • 4:45 min. • July 8th, 2025
A microglia - os macrófagos residentes no cérebro - expressa CD11b, uma integrina da superfície celular.
Para isolar a micróglia do cérebro de filhotes de camundongos, pegue fragmentos de cérebro em tubos de dissociação contendo tampão com papaína, uma enzima proteolítica e desoxirribonuclease.
Coloque os tubos em um dissociador mecânico. Durante a execução, o dissociador rompe mecanicamente o tecido.
A papaína digere a matriz extracelular do tecido, liberando células, incluindo a microglia, em suspensão. A desoxirribonuclease degrada o DNA livre em suspensão, evitando o isolamento celular ineficiente.
centrifuga. Complete a dissociação mecânica por pipetagem. Transfira a suspensão através de um filtro de células para remover detritos e aglomerados de células e obter uma população unicelular homogênea.
Incubar com microesferas superparamagnéticas funcionalizadas com anticorpos anti-CD11b. As microesferas se ligam especificamente ao CD11b nas células, incluindo a microglia.
Pós-incubação, centrífuga. Remova o sobrenadante contendo contas não encadernadas. Ressuspenda as células no buffer. Carregue em uma coluna colocada em um separador magnético. A coluna é composta por uma matriz com esferas ferromagnéticas.
Quando colocadas no separador, as esferas dentro da coluna amplificam o campo magnético, retendo as células CD11b+ ligadas a microesferas dentro da coluna, enquanto outras células fluem.
Remova do separador e use o tampão para eluir as células CD11b + da coluna. Centrifugue a suspensão e ressuspenda as células CD11b+ em um meio de micróglia.
As células isoladas estão prontas para análise posterior.
Prepare a mistura de dissociação de acordo com esta tabela. Transfira 12 pedaços de cérebro para um tubo C para um peso total de 1,2 gramas por tubo de dissociação. Em seguida, coloque tubos C no dissociador com aquecimento. Inicie o programa NTDK otimizado no dissociador. Centrifugue por 20 segundos. Complete a dissociação mecânica pipetando três vezes.
Transfira as células para quatro tubos de 15 mililitros com filtros conectados. Enxágue os filtros com 10 mililitros de HBSS com cálcio e magnésio. Centrifugue durante 10 minutos e retire o sobrenadante com uma pipeta de 10 mililitros. Com cuidado, adicione 10 mililitros de HBSS com cálcio e magnésio e ressuspenda o pellet. Novamente, centrifugue e remova o sobrenadante.
Ressuspenda o pellet com 6 mililitros de tampão de classificação. Repita a centrifugação e descarte o sobrenadante. Em seguida, adicione 200 microlitros de solução de microesferas CD11b e incube os tubos por 15 a 20 minutos a 4 graus Celsius. Após a incubação, ressuspenda o pellet com 6 mililitros de tampão de classificação. Repita a centrifugação e ressuspenda o pellet com 8 mililitros de tampão de triagem.
Em seguida, siga o programa POSSEL no separador para preparar oito colunas. Passe as células pela coluna adicionando 1 mililitro de suspensão celular de cada vez. Com 1 mililitro de tampão de classificação, eluir células CD11b positivas em uma placa de eluição estéril. Agrupe as células em um tubo de 50 mililitros.
Centrifugue e ressuspenda o pellet com 10 mililitros de meio microglia frio. Conte as células CD11b positivas. Ressuspenda as células em meio de microglia fria para obter uma concentração final de 650.000 a 700.000 células por mililitro.