Avaliação da colite induzida por produtos químicos por meio da análise imuno-histoquímica de seções de tecido do cólon

Em camundongos, a camada mucosa do cólon consiste em células imunes contendo lâmina própria, cercadas por um epitélio compactado que protege a mucosa. O tratamento químico com sulfato de sódio dextrano interrompe as junções apertadas, causando danos às células epiteliais e permitindo que micróbios luminais penetrem na lâmina própria.

O reconhecimento microbiano no cólon desencadeia a secreção de quimiocinas, levando à infiltração de células imunes e à liberação de citocinas pró-inflamatórias. Essa resposta imune exagerada resulta em inflamação ou colite do cólon.

Para avaliar a colite induzida por produtos químicos, comece com uma lâmina de vidro carregando uma seção fixa de tecido do cólon de camundongo pré-tratada exibindo colite induzida por produtos químicos. Trate a seção com um coquetel de anticorpos primários específicos para os receptores de células imunes que se ligam às suas respectivas células imunes.

Lave para remover anticorpos não ligados. Incube a seção do tecido com anticorpos secundários biotinilados, que se ligam especificamente aos anticorpos primários. Incubar com os conjugados da enzima estreptavidina, que interagem com as biotinas, formando complexos.

Cubra a seção do tecido com um substrato cromogênico; a interação enzima-substrato confere coloração marrom às células imunes. Contra-core a seção com corante de hematoxilina para corar os núcleos das células.

Observe a lâmina corada ao microscópio. A abundância de células imunológicas marrons na área danificada indica colite induzida por produtos químicos.

Para análise imuno-histoquímica, após aquecer os cortes por 20 minutos na placa quente, lavar as lâminas três vezes em PBS por 10 minutos por lavagem e eliminar a peroxidase endógena com uma incubação de peróxido de hidrogênio a 3% por 10 minutos.

No final da incubação, lavar as amostras três vezes em PBS, conforme demonstrado, e bloquear qualquer ligação inespecífica com tampão de bloqueio, durante pelo menos uma hora à temperatura ambiente. Em seguida, substitua o tampão de bloqueio pelo coquetel de anticorpos primários de interesse para uma incubação noturna a 4 graus Celsius.

Na manhã seguinte, aspire o excesso de solução de anticorpo primário e lave as lâminas três vezes em PBS. Após a última lavagem, incubar as lâminas com o cocktail de anticorpos secundários biotinilados adequado, seguido de uma marcação com complexo de peroxidase de estreptavidina rábano à temperatura ambiente.

Para visualizar as células imunorreativas, rotule as amostras com DAB até que uma cor marrom clara ou escura se desenvolva e contra-core as seções com hematoxilina e amônia diluída a 0,3%.

Quando as lâminas secarem, use um microscópio de luz para obter imagens de campo claro das seções de tecido com uma ampliação de 10 vezes e use um programa de processamento de imagem para identificar e quantificar a população das células imunes marcadas no epitélio e na lâmina própria.