Matando células K562 por células mononucleares do sangue periférico expostas a preparações de produtos de tabaco

As células tumorais ativam as células imunes efetoras para liberar citocinas e grânulos citolíticos contendo perforina e granzimas. A perforina forma poros na membrana da célula tumoral, facilitando a entrada da granzima na célula e iniciando a apoptose, causando a morte celular.

Para analisar a função citolítica das células mononucleares do sangue periférico humano, PBMCs, após a preparação do produto de tabaco, TPP, exposição, pegue uma placa de vários poços com concentrações crescentes de TPP. Um poço contendo meio atua como controle.

Adicione a suspensão PBMC. O principal agente imunossupressor das TPPs, a nicotina, liga-se aos receptores nicotínicos de acetilcolina dos PBMCs, regulando negativamente a produção de citocinas pró-inflamatórias.

centrifuga. Remova o sobrenadante contendo TPP. Ressuspenda os PBMCs na mídia. Adicione células K562 marcadas com fluorescência, células leucêmicas humanas com maior suscetibilidade à citotoxicidade das células efetoras de PBMC, aos poços.

As

células efetoras tratadas com TPP com respostas imunes suprimidas exibem expressão reduzida de perforina e liberação de citocinas, diminuindo a capacidade citolítica do PBMC.

centrifuga. Ressuspenda as células em um tampão seguido por um corante fluorescente impermeável às células. O corante entra nas células com membranas comprometidas e mancha o DNA.

Usando um citômetro de fluxo, determine a proporção de células K562 mortas e vivas nos poços. Uma porcentagem menor de células K562 mortas em poços com concentrações mais altas de TPP do que o controle indica supressão da morte de células K562 por PBMCs tratados com TPP.

Depois de preparar um prato de PBMCs tratados com produtos de tabaco, como acabamos de demonstrar, lave uma cultura de células K562 colhidas a uma confluência de 80% em 10 mililitros de DPBS. Ressuspenda o pellet em 5 mililitros de DPBS e conte as células. Em seguida, adicione 1 mililitro de solução de trabalho CFSE recém-preparada a 1 a 2 vezes 10 às sétimas células K562 em 1 mililitro de meio completo e disperse a coloração celular por vórtice.

Incube as células à temperatura ambiente. Após exatamente 2 minutos, adicione 200 microlitros de FBS e vortex as células novamente, incubando-as por mais dois minutos.

Após a segunda incubação, lave as células em 10 mililitros de meio completo. Em seguida, ressuspenda o pellet em mais 10 mililitros de meio completo e conte as células. Agora, centrifugue os PBMCs tratados com tabaco e decanta o sobrenadante. Em seguida, recoloque a tampa, ressuspenda as células por vórtice e lave-as em 200 microlitros de meio completo por poço.

Para iniciar o ensaio de morte, adicione as células K562 marcadas com CFSE aos PBMCs na proporção de 1 para 15 e incube a co-cultura a 37 graus Celsius e 5% de CO2.

Após cinco horas, gire as células e descarte o sobrenadante. Ressuspenda os pellets por vórtice e, em seguida, lave as células com 200 microlitros de tampão de funcionamento por poço. Em seguida, adicione 95 microlitros de tampão de corrida seguidos de 5 microlitros de 7-AAD, para um volume total de 100 microlitros por poço.

Finalmente, incube as células no escuro à temperatura ambiente por 15 minutos, em seguida, adicione 100 microlitros de tampão de corrida a cada poço e transfira todo o volume para os tubos FACS correspondentes apropriados para determinar a porcentagem de células 7-AAD e CFSE-positivas por análise citométrica de fluxo.