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Para induzir a inflamação sistêmica - uma resposta inflamatória generalizada, comece posicionando um camundongo anestesiado com o lado dorsal para cima. Pegue uma seringa contendo emulsão micobacteriana de depósitos de antígeno-adjuvante micobacteriano - um reservatório de óleo localizado da mistura antígeno-adjuvante.
Perfure as camadas da epiderme e da derme da pele do camundongo e injete a emulsão adjuvante do antígeno por via subcutânea proximal ao linfonodo inguinal. Após a injeção, o depósito libera continuamente antígenos no tecido circundante - proporcionando exposição prolongada dos antígenos ao sistema imunológico.
As células apresentadoras de antígenos, ou APCs, no tecido, interagem com antígenos micobacterianos injetados, internalizam-nos e os processam em peptídeos. Esses peptídeos são então apresentados na superfície das APCs usando os principais complexos de histocompatibilidade, desencadeando a liberação de citocinas pró-inflamatórias e quimiocinas.
Esse processo gera inflamação localizada e desencadeia a abertura dos vasos linfáticos, permitindo a entrada de células imunes, incluindo APCs portadoras de antígenos, no sistema linfático e atingindo o linfonodo inguinal.
Nos linfonodos, os receptores de células T das células T auxiliares interagem com antígenos na superfície das APCs e são ativados. As células T ativadas liberam citocinas pró-inflamatórias, que viajam pelos vasos linfáticos e são liberadas em vários outros tecidos.
As citocinas pró-inflamatórias liberadas atraem as células imunes para esses tecidos, induzindo inflamação sistêmica.
Para começar, solte o corpo da unidade conversora do sonicador e limpe a sonda com um cotonete embebido em álcool 70%. Em seguida, ligue o sonicador e ajuste a configuração de potência para 4, girando o botão de controle de energia.
Em seguida, para gerar uma suspensão fina do Mycobacterium tuberculosis H37Ra em PBS, mergulhe a ponta da sonda no pó de micobactérias contendo PBS. Sonicar a mistura no gelo por 30 segundos, depois fazer uma pausa de 30 segundos e repetir por um total de 5 minutos para dispersar totalmente o pó em uma suspensão uniforme sem aquecer o líquido. Em seguida, adicione 2,5 mililitros do adjuvante incompleto de Freund à mistura e repita o processo de sonicação no gelo até que a emulsão forme uma consistência semelhante à de pasta de dente.
Para a injeção subcutânea, coloque 200 a 300 microlitros da emulsão micobacteriana em uma seringa de 1 mililitro. Expulse o ar da seringa e continue enchendo a seringa, invertendo e batendo intermitentemente, até encher.
Em seguida, coloque as injeções subcutâneas na superfície dorsal dos quadris ou na superfície ventral das pernas proximal à região dos gânglios linfáticos inguinais de um camundongo C57Black / 6J anestesiado de 6 a 10 semanas. Insira cuidadosamente a agulha, tomando cuidado para não penetrar no músculo, e injete 50 microlitros da emulsão no espaço subcutâneo. Não remova a agulha imediatamente para permitir que a emulsão espessa seja totalmente injetada.