Name: Intra Transplante de Células de Segmentação Chifre Cervical Ventral em Esclerose Lateral Amiotrófica e lesão medular traumática (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Aprenda o transplante de células precursoras neurais para o corno ventral cervical em modelos de ELA e lesão medular. Este protocolo detalhado permite proteger ou substituir neurônios motores frênicos disfuncionais em roedores.

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Gostaria de agradecer: todos os membros da Lepore, Maragakis e Rothstein laboratórios para discussão útil; Os Veteranos Paralisados ​​da América e do Craig H. Neilsen Fundação para o financiamento.

<ol><li>Lane, M. A., Fuller, D. D., White, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+recovery+following+high+cervical+hemisection%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+neurosciences%22%5BJournal%5D)">Respiratory recovery following high cervical hemisection.</a> Trends in neurosciences. 31, 538-538 (2008).</li>
<li>Kaplan, L. M., Hollander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+dysfunction+in+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chest.+Med%22%5BJournal%5D)">Respiratory dysfunction in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Clin. Chest. Med. 15, 675-675 (1994).</li>
<li>Miller, R. G., Rosenberg, J. A., Gelinas, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practice+parameter%3A+the+care+of+the+patient+with+amyotrophic+lateral+sclerosis+%28an+evidence-based+review%29%3A+report+of+the+Quality+Standards+Subcommittee+of+the+American+Academy+of+Neurology%3A+ALS+Practice+Parameters+Task+Force%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Practice parameter: the care of the patient with amyotrophic lateral sclerosis (an evidence-based review): report of the Quality Standards Subcommittee of the American Academy of Neurology: ALS Practice Parameters Task Force.</a> Neurology. 52, 1311-1323 (1999).</li>
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<li>Tandan, R., Bradley, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyotrophic+leteral+sclerosis%3A+Part+2.+Etiopathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+neurology%22%5BJournal%5D)">Amyotrophic leteral sclerosis: Part 2. Etiopathogenesis.</a> Annals of neurology. 18, 419-419 (1985).</li>
<li>Bruijn, L. I., Miller, T. M., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+mechanisms+involved+in+motor+neuron+degeneration+in+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Unraveling the mechanisms involved in motor neuron degeneration in ALS.</a> Annu Rev Neurosci. 27, 723-723 (2004).</li>
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<li>Bruijn, L. I., Becher, M. W., Lee, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALS-linked+SOD1+mutant+G85R+mediates+damage+to+astrocytes+and+promotes+rapidly+progressive+disease+with+SOD1-containing+inclusions%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">ALS-linked SOD1 mutant G85R mediates damage to astrocytes and promotes rapidly progressive disease with SOD1-containing inclusions.</a> Neuron. 18, 327-327 (1997).</li>
<li>Gurney, M. E., Pu, H., Chiu, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neuron+degeneration+in+mice+that+express+a+human+Cu%2CZn+superoxide+dismutase+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation.</a> Science. 264, 1772-1775 (1994).</li>
<li>Howland, D. S., Liu, J., She, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+loss+of+the+glutamate+transporter+EAAT2+in+a+transgenic+rat+model+of+SOD1+mutant-mediated+amyotrophic+lateral+sclerosis+%28ALS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Focal loss of the glutamate transporter EAAT2 in a transgenic rat model of SOD1 mutant-mediated amyotrophic lateral sclerosis (ALS).</a> Proc Natl Acad Sci. 99, 1604-1604 (2002).</li>
<li>Nagai, M., Aoki, M., Miyoshi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rats+expressing+human+cytosolic+copper-zinc+superoxide+dismutase+transgenes+with+amyotrophic+lateral+sclerosis%3A+associated+mutations+develop+motor+neuron+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Rats expressing human cytosolic copper-zinc superoxide dismutase transgenes with amyotrophic lateral sclerosis: associated mutations develop motor neuron disease.</a> J. Neurosci. 21, 9246-9246 (2001).</li>
<li>McDonald, W., Becker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+cord+injury%3A+promising+interventions+and+realistic+goals%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Phys.+Med.+Rehabi%22%5BJournal%5D)">Spinal cord injury: promising interventions and realistic goals.</a> Am. J. Phys. Med. Rehabi. I82, S38-S38 (2003).</li>
<li>Sandrow-Feinberg, H. R., Zhukareva, V., Santi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEGylated+interferon-beta+modulates+the+acute+inflammatory+response+and+recovery+when+combined+with+forced+exercise+following+cervical+spinal+contusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+neurology%22%5BJournal%5D)">PEGylated interferon-beta modulates the acute inflammatory response and recovery when combined with forced exercise following cervical spinal contusion injury.</a> Experimental neurology. 223, 439-451 (2010).</li>
<li>Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mammalian neural stem cells.</a> Science. 287, 1433-1433 (2000).</li>
<li>Lane, M. A., Lee, K. Z., Fuller, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+circuitry+and+respiratory+recovery+following+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Respiratory+physiology+%26+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Spinal circuitry and respiratory recovery following spinal cord injury.</a> Respiratory physiology & neurobiology. 169, 123-123 (2009).</li>
<li>Lepore, A. C., Rauck, B., Dejea, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+transplantation-based+astrocyte+replacement+is+neuroprotective+in+a+model+of+motor+neuron+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Focal transplantation-based astrocyte replacement is neuroprotective in a model of motor neuron disease.</a> Nature. 11, 1294-1294 (2008).</li>
<li>Rao, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+and+Restricted+Precursors+in+the+Central+Nervous+System%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Multipotent and Restricted Precursors in the Central Nervous System.</a> Anat Rec. 257, 137-137 (1999).</li>
<li>Rao, M. S., Mayer-Proschel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial-+restricted+precursors+are+derived+from+multipotent+neuroepithelial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Glial- restricted precursors are derived from multipotent neuroepithelial stem cells.</a> Dev Biol. 188, 48-48 (1997).</li>
<li>Suzuki, M., Tork, C., Shelley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexual+dimorphism+in+disease+onset+and+progression+of+a+rat+model+of+ALS.+Sexual+dimorphism+in+disease+onset+and+progression+of+a+rat+model+of+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Amyotroph+Lateral+Scler%22%5BJournal%5D)">Sexual dimorphism in disease onset and progression of a rat model of ALS. Sexual dimorphism in disease onset and progression of a rat model of ALS.</a> Amyotroph Lateral Scler. 8, 20-20 (2007).</li>
<li>Lepore, A. C., Haenggeli, C., Gasmi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraparenchymal+spinal+cord+delivery+of+adeno-associated+virus+IGF-1+is+protective+in+the+SOD1G93A+model+of+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+research%22%5BJournal%5D)">Intraparenchymal spinal cord delivery of adeno-associated virus IGF-1 is protective in the SOD1G93A model of ALS.</a> Brain research. 1185, 256-256 (2007).</li>
<li>Veldink, J. H., Bar, P. R., Joosten, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexual+differences+in+onset+of+disease+and+response+to+exercise+in+a+transgenic+model+of+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscul+Disord%22%5BJournal%5D)">Sexual differences in onset of disease and response to exercise in a transgenic model of ALS.</a> Neuromuscul Disord. 13, 737-737 (2003).</li>
<li>Shumsky, J. S., Lepore, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+Neuronal+and+Glial+Restricted+Precursors+into+Contused+Spinal+Cord+Improves+Bladder+and+Motor+Functions%2C+Decreases+Thermal+Hypersensitivity%2C+and+Modifies+Intraspinal+Circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Transplantation of Neuronal and Glial Restricted Precursors into Contused Spinal Cord Improves Bladder and Motor Functions, Decreases Thermal Hypersensitivity, and Modifies Intraspinal Circuitry.</a> J. Neurosci. 25, 9624-9624 (2005).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Para estudos envolvendo ratos SOD1 G93A e ratos, idade e sexo-match os animais dentro de um grupo, e distribuir os animais dentro da mesma ninhada a diferentes grupos. É preferível usar todos os animais do mesmo sexo para ambos ALS e modelos SCI porque os processos de doença pode ser diferente entre machos e fêmeas, no entanto, também pode ser útil ter animais de ambos os sexos suficiente para detectar possíveis efeitos específicos de sexo, como este fenômeno tem sido relatada com SOD1 G93A 13 e ra...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Gibco </td><td> 14170 </td></tr><tr><td> Tripsina 0,05% </td><td> Gibco </td><td> 25300 </td></tr><tr><td> Inibidor de tripsina de soja (opcional) </td><td> Sigma </td><td> T-6522 </td></tr><tr><td> Acepromazina maleato (0,7 mg / kg) </td><td> Fermentação da Saúde Animal </td><td></td></tr><tr><td> Ketamina (95 mg / kg) </td><td> Fort Dodge Saúde Animal </td><td></td></tr><tr><td> Xilazina (10 mg / kg) </td><td> Bayer </td><td></td></tr><tr><td> # Feather lâmina cirúrgica 11 </td><td> Microscopia Eletrônica de Ciências </td><td> 72044-11 </td></tr><tr><td> Aplicadores com ponta de algodão (6 polegadas) </td><td> Pescador </td><td> 23-400-101 </td></tr><tr><td> Rat-toothed forceps </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td><td> Rat: 11023-15; Mouse: 11042-08 </td></tr><tr><td> Médias empresas tesoura primavera </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td><td> 15012-12 </td></tr><tr><td> Mini mola tesoura </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td><td> 15000-10 </td></tr><tr><td> Rongeur </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td><td> Rat: 16121-14; Mouse: 16221-14 </td></tr><tr><td> Microknife </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td><td> 10056-12 </td></tr><tr><td> Porta-agulhas </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td><td> 12502-14 </td></tr><tr><td> Sutura: 4-0 </td><td> Vicryl </td><td> S-183 </td></tr><tr><td> Staples: 9 mm </td><td> Autoclip </td><td> 427631 </td></tr><tr><td> Grampeador: 9 mm (Reflex # 203-1000) </td><td> Precision Instruments mundo </td><td> 5000344 </td></tr><tr><td> Bomba de água quente (T Bomba /) </td><td> Gaymar </td><td> P / N 07999-000 </td></tr><tr><td> Ciclosporina A: 250,0 mg/5.0 mL ampolas </td><td> Novartis / Sandimmune </td><td> NDC 0078-0109-01 </td></tr><tr><td> FK-506 </td><td> LC Laboratories </td><td> F-4900 </td></tr><tr><td> Rapamicina </td><td> LC Laboratories </td><td> R-5000 </td></tr><tr><td> Injetor </td><td> Precision Instruments mundo </td><td> UMP2 </td></tr><tr><td> 4 Micro Controlador de Bombas Microsseringa </td><td> Precision Instruments mundo </td><td> UMC4 </td></tr><tr><td> Micromanipulador </td><td> Precision Instruments mundo </td><td> Kite-R </td></tr><tr><td> 10,0 mL seringa Hamilton </td><td> Hamilton </td><td> 80030 </td></tr><tr><td> Agulhas Hamilton: 33 gauge, 45 de bisel °, 1 polegada </td><td> Hamilton </td><td> 7803-05 </td></tr><tr><td> 20,0 mL de vidro pipetas microcapilar (opcional) </td><td> Kimble </td><td> 71900-20 </td></tr></tbody></table>

intra transplante de células de segmentação chifre cervical ventral em esclerose lateral amiotrófica e lesão medular traumática

Intraspinal Cell Transplantation for Targeting Cervical Ventral Horn in Amyotrophic Lateral Sclerosis and Traumatic Spinal Cord Injury

Comprometimento respiratório devido à perda de neurônio motor frênico é uma conseqüência debilitantes de uma grande proporção de lesão da medula espinhal humana traumático (SCI) casos 1 e é a causa final da morte em pacientes com a doença do neurônio motor, esclerose amiotrófica laterais (ALS) 2. ALS é uma doença devastadora neurológico que se caracteriza pela degeneração relativamente rápida de letras maiúsculas e neurônios motores inferiores. Pacientes finalmente sucumbir à doença, em média, 2-5 anos após o diagnóstico devido à paralisia respiratória devido à perda de innnervation frênico do neurônio motor do diafragma 3. A grande maioria dos casos são esporádicos, enquanto 10% são da forma familiar. Cerca de vinte por cento de casos familiares estão ligados a várias mutações pontuais no gene Cu / Zn superóxido dismutase 1 (SOD1) no cromossomo 21 4. Camundongos transgênicos e ratos 4,5 6 carregando humana mutante SOD1 genes (G93A, G37R, G86R, G85R) foram gerados, e, apesar da existência de outros modelos animais de perda de neurônios motores, são atualmente os modelos mais altamente utilizado da doença . Lesão da medula espinal (SCI) é um conjunto heterogêneo de condições resultantes de trauma físico para a medula espinhal, com resultado funcional variando de acordo com o tipo, localização e gravidade da lesão 7. No entanto, aproximadamente metade dos casos humanos SCI afetar regiões cervical, resultando em disfunção respiratória debilitante devido à perda frênico neurônio motor e ferimentos descendente axônios respiratórias bulbo-espinal 1. Uma série de modelos animais de SCI têm sido desenvolvidas, com os mais comumente utilizados e clinicamente relevante é a contusão 8. Transplante de várias classes de células precursoras neurais (NPCs) é uma promissora estratégia terapêutica para o tratamento de lesões traumáticas do SNC e neurodegeneração, incluindo ALS e SCI, por causa da capacidade de substituir neuroproteção perdido ou disfuncional tipos de células do SNC, fornecer, entregar e fatores genéticos de interesse 9. Modelos animais de ambos os ALS e SCI pode modelar muitos aspectos clinicamente relevantes dessas doenças, incluindo a perda do neurônio motor frênico e conseqüente comprometimento respiratório 10,11. , A fim de avaliar a eficácia da NPC estratégias baseadas na função respiratória nestes modelos animais de ALS e SCI, as intervenções de celulares deve ser especificamente direcionada para regiões que contêm alvos terapêuticos relevantes, tais como os neurônios motores frênico. Nós fornecemos um protocolo detalhado para multi-segmentar transplante, intraspinal de NPCs para o assunto da coluna cervical ventral cabo cinza de modelos neurodegenerativas, como ratos SOD1 G93A e ratos, assim como os ratos com lesão medular e camundongos 11.

Transplante precursoras neurais é uma estratégia promissora para a proteção e / ou substituição perdido / cervical disfuncional neurônios motores frênicos em lesão medular (SCI) e do neurônio motor doença, a esclerose amiotrófica laterais (ALS). Nós fornecemos um protocolo para entrega celular para chifre da medula espinhal cervical ventral em modelos de roedores da ALS e SCI.

Intra Transplante de Células de Segmentação Chifre Cervical Ventral em Esclerose Lateral Amiotrófica e lesão medular traumática

O comprometimento respiratório devido à perda de neurônios motores frênicos é uma consequência debilitante de uma grande proporção de lesões medulares (LM) traumáticas humanas...

O objetivo geral deste procedimento é realizar um transplante segmentar e multissegmentar intrarraquidiano de células precursoras neurais na medula espinhal cervical, no parênquima cinzento ventral, tanto de ratos quanto de camundongos. Isso é realizado primeiramente preparando o tipo de célula precursora neural de interesse para transplante. Em seguida, realiza-se uma laminectomia na medula espinhal em cada ponto de transplante celular pretendido.Em seguida, as células são injetadas corretamente nos locais e profundidades apropriados para direcionar com precisão a entrega celular à coluna anterior do cordão espinhal cervical. O passo final é continuar administrando imunossupressão ao animal até o sacrifício, a fim de garantir a sobrevivência das células transplantadas na medula espinhal. Em última análise, podem-se obter resultados para acompanhar a sobrevivência, migração e diferenciação das células precursoras neurais transplantadas na medula espinhal cervical de adulto em diferentes pontos temporais após o transplante, por meio de métodos histológicos como imunohistoquímica e análise subsequente por microscopia.A demonstração visual neste método é fundamental, pois muitos dos complexos passos cirúrgicos na medula espinhal e de transplante celular são difíceis de aprender, já que exigem grande cuidado e técnicas específicas, os quais são facilitados com esses procedimentos. Se os procedimentos recomendados forem utilizados, imunossuprima o animal três dias antes do transplante, administrando injeções diárias de 10 miligramas por quilograma de peso corporal de ciclosporina A por via subcutânea. Se células derivadas de roedores forem transplantadas, ou um miligrama por quilograma de peso corporal de ambos FK506 e rapamicina por via intraperitoneal.Se células derivadas de humanos forem ser transplantadas, modele também clipes de papel resistentes para formar afastadores. Quebre uma parte do clipe para fazer um gancho e dobre a outra extremidade do clipe em um pequeno laço. Em seguida, amarre um barbante através do laço de cada afastador, autoclave os afastadores e todos os instrumentos que serão utilizados na cirurgia no dia da cirurgia.Prepare alíquotas de células progenitoras da glia ou outras células a serem transplantadas de acordo com os procedimentos descritos no protocolo escrito. Após a coleta das células, distribua as suspensões celulares entre vários tubos microcentrífugos de 1,5 mililitro e mantenha-os em gelo úmido. Em seguida, após administrar um método apropriado de anestesia ao animal, confirme que um nível anestésico adequado para cirurgia foi alcançado realizando um aperto no dedo do pé.Utilize uma máquina de barbear elétrica para raspar as costas do animal, raspando bem os pelos de uma área ligeiramente rostral aos ouvidos até o meio das costas e removendo os pelos cortados da pele para evitar que entrem na incisão. Em seguida, umedeça um pedaço de gaze com solução antisséptica de poviodona-iodo e aplique sobre a pele da área raspada. Esfregue pelo menos duas vezes com a solução antisséptica e duas vezes com álcool ou desinfetante diluído, em movimentos circulares.Partindo do local da incisão e seguindo em direção para fora até a linha do cabelo. Coloque uma compressa de gaze estéril enrolada sobre uma placa cirúrgica limpa e fixe a compressa na placa com fita adesiva para que não se mova. Coloque o animal sobre a gaze enrolada em posição de feto.Estenda ambos os braços do animal sobre a almofada e, em seguida, prenda-os com fita adesiva à almofada e à placa cirúrgica para elevar a medula espinhal cervical. Isso facilitará o trabalho durante toda a cirurgia, já que o cordão cervical encontra-se profundamente abaixo da superfície da pele. Deve-se utilizar um campo cirúrgico estéril durante este procedimento, embora isso não seja mostrado no vídeo por motivos de demonstração.Primeiro, observando por meio de um microscópio cirúrgico ajustado na menor ampliação, utilize um bisturi estéril e afiado para fazer uma incisão mediana da base do crânio até a escápula. Em seguida, faça uma incisão através das três camadas musculares sobre a coluna vertebral. Aplique pressão suficiente para cortar todas as camadas musculares com o menor número possível de cortes, mas não pressione com muita força, pois isso pode causar danos aos tecidos mais profundos com dois aplicadores de algodão em ponta.Use um movimento de torção para separar o músculo superficial do músculo paravertebral. Não corte nem rasgue o músculo, pois isso causará hemorragia. Posicione quatro dos retratores caseiros para retrair o músculo.Em seguida, puxe cada um dos quatro retratores para os quatro cantos e prenda as cordas na tábua para fixar o retrator. A exposição final deve ter formato quadrado ou retangular. Utilize pinças com dentes de rato e tesouras de mola de tamanho médio para remover o músculo paravertebral da superfície dorsal das vértebras.Realize os cortes bem próximos ao osso para expor melhor a superfície óssea. Certifique-se de que os cortes sejam paralelos à superfície das vértebras, mas não corte profundamente até o cordão. Substitua a tesoura de mola de tamanho médio por uma tesoura crua.Em seguida, fixe toda a coluna vertebral segurando o músculo sobre o processo C2 com pinça dentada e use a tesoura para afastar o músculo nos níveis C4, C5 e C6. Em seguida, inicie uma laminectomia em C5. Novamente, fixe a área segurando C2 com pinça dentada.Segure toda a lâmina com a pinça crua e posicione a lâmina de forma que a ferramenta fique completamente perpendicular ao eixo da coluna vertebral. Lentamente e com cuidado, esmague a lâmina sem pressionar para baixo na medula espinhal. Em seguida, puxe suavemente para cima o fragmento ósseo quebrado.Em seguida, posicione o afastador cru perpendicularmente à coluna vertebral. Então, insira suavemente o afastador cru sob o osso com um ângulo de 30 a 60 graus em relação à superfície da medula. Faça pequenos cortes para estender a laminectomia a todas as lâminas de C4 a C6.Não estenda a laminectomia muito lateralmente, pois isso causará hemorragia. Aumente a ampliação do microscópio para cerca de 15 x e foque na medula. Use pinça reta e afiada.Pinceis número cinco para remover o tecido conjuntivo sobre a dura-máter. Em seguida, utilize tesoura miniatura de mola ou um micro bisturi para incisar a dura-máter paralelamente ao eixo da coluna vertebral. Em um ponto logo medial à zona de entrada dos filetes dorsais, certifique-se de que a dura-máter seja perfurada no local da injeção.Após perfurar, o líquido cefalorraquidiano da dura irá escorrer; seque a superfície da medula e toda a área exposta com gaze ou um aplicador de algodão. Use uma pinça para segurar e levantar levemente a dura afastando-a da medula espinhal, sem pinçar ou lesar a medula espinhal. Estenda ligeiramente a incisão ao longo do eixo cordal rostral utilizando uma seringa descartável do tipo gast de 10 microlitros da Hamilton com agulha removível.Equipado com uma agulha metálica Hamilton de 33 graus, com bisel de 45 graus. Carregue lentamente o volume necessário de suspensão celular para um local de injeção. Abaixe a ponta da agulha em direção à superfície dorsal da medula espinhal, monitorando seu avanço através do microscópio.Alinhe a seringa com o eixo da coluna vertebral para direcionar corretamente a região anatômica desejada, posicionando a agulha o mais próximo possível de 90 graus e logo medial à zona de entrada das raízes dorsais. Toque suavemente a superfície da medula espinhal com a ponta da agulha, levemente comprimindo a medula espinhal com a ponta da agulha. Em seguida, retire a agulha até que a medula espinhal retorne à posição normal.Registre esta posição como Z igual a 0,0 utilizando a régua do micromanipulador. Em seguida, monitorando visualmente o avanço pelo microscópio, abaixe levemente a agulha para dentro da medula espinhal. Abaixe a agulha em 1,5 milímetros para atingir o corno ventral em um rato adulto.Deixe a agulha no lugar por dois a cinco minutos antes de iniciar a injeção. Certifique-se de que a configuração cirúrgica permaneça inalterada durante este período. Em seguida, injete dois microlitros de células ao longo de dois a cinco minutos, em uma taxa constante, utilizando o controlador de bomba; após a injeção, deixe a agulha no lugar por dois a cinco minutos.Em seguida, retire cuidadosamente a agulha da medula espinhal. Repita o processo de injeção em outros locais-alvo. Após a injeção em todos os locais-alvo, retorne o microscópio para a menor ampliação e realize a sutura.Fechei as três camadas musculares superficiais simultaneamente com sutura zero em quatro pontos musculares em três localizações ao longo do eixo cordal rostral. Feche a pele com grampos cirúrgicos de nove milímetros, garantindo que os grampos estejam espaçados aproximadamente 0,5 centímetros um do outro. Aperte os grampos com pinças de agulha para impedir que o animal os remova antes da completa cicatrização da ferida.Aplicar a solução antisséptica de povídone com iodo na área do ferimento cirúrgico com gaze embebida e permitir que o animal se recupere da anestesia sobre uma placa aquecida com água circulante. Continuar as injeções diárias de ciclosporina A ou rapamicina FK506 até o sacrifício, quando 50.000 camundongos chegaram. Células progenitoras de gliócitos foram transplantadas no corno ventral da medula espinhal no nível C4 em um rato SOD1G93A.Esta imagem mostra que o camundongo M dois positivo chegou, as células transplantadas sobreviveram por um mês após o transplante e que as células se localizaram na substância cinzenta ventral, mas o local da injeção medialmente errou o corno ventral lateral, conforme indicado pela linha pontilhada. Como visto aqui, a injeção de um número muito maior de células nesta região resulta em danos no local da injeção e ao longo do trajeto da agulha. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em aproximadamente 45 a 60 minutos para seis locais de injeção, se for executada corretamente.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

O transplante de células-tronco do mouse neural (NSCs) na medula espinhal de ratos com desmielinização estabelecida é detalhado. A preparação de NSCs, a laminectomia de vértebra torácica 9 (T9), e transplante de NSCs é descrito juntamente com os cuidados pré e pós-operatório dos ratos.

Transplante de Células-Tronco cirúrgica do rato Neural na medula espinhal de camundongos infectados com o vírus da Hepatite neurotrófico rato

Fonte: Zweckberger, K., et al. Uso sinérgico de células precursoras neurais e peptídeos auto-montáveis em lesão experimental da medula espinhal cervical.  J. Vis. Exp. (2015).Este protocolo demonstra uma abordagem de injeção direcionada para reparo de lesão medular em um modelo de rato. Envolve a entrega de peptídeos de automontagem (SAPs) no núcleo da lesão para criar um andaime de suporte, seguido por injeções de células precursoras neurais (NPC) ao redor da lesão para remodelar o tecido.

Injeção de peptídeos automontáveis e células precursoras neurais para reparo da medula espinhal em um modelo de rato

Matrizes de fibrina que contêm factores de crescimento foram utilizados para reter as células estaminais neurais enxertados em locais de completa a transecção da medula espinal. Células enxertadas encheu completamente a cavidade lesão e diferenciado em vários tipos de células neurais, incluindo neurônios que se estenderam axônios em acolhimento medula espinhal através de longas distâncias.

Promoção da sobrevivência e diferenciação de células-tronco neurais com fibrina e Fator de Crescimento Cocktails após Spinal Cord Injury grave

O tratamento da lesão medular cervical com peptídeos de automontagem (SAP) e células precursoras neurais (NPC), juntamente com fatores de crescimento, é uma abordagem promissora para promover a regeneração e a recuperação. Um modelo de rato clipe de aneurisma de contusão/compressão de SCI cervical e tratamento combinado envolvendo injeção de SAP e transplante de NPC é estabelecido.

Use Synergetic de células neuronais precursoras e Peptídeos de auto-montagem em Experimental Cervical Spinal Cord Injury

A lesão medular é uma condição traumática que causa grave morbidade e mortalidade elevada. Neste trabalho, descrever em detalhes um modelo contusão de lesão medular em ratos, seguido por um transplante de células-tronco neurais.

Neural Stem Cell Transplantation em Experimental contusão Model of Spinal Cord Injury

Lesões graves na medula espinhal geralmente resultam em defeitos teciduais. Duas possibilidades são descritas para preencher com sucesso essas lacunas para promover a adaptação tecidual, respostas regenerativas e melhora funcional em ratos por meio do implante de um sistema de microconectores mecânicos após lesão aguda e cinco semanas após a transecção completa da medula espinhal.

Estratégias experimentais para Ponte grandes lacunas de tecido na medula espinhal ferido após aguda e lesão crônica

Este artigo descreve uma técnica para inserir um canal oco entre os cotos de medula espinhal após a transecção completa e preenchimento com células de Schwann (SCs) e matriz de injetável membrana basal para ponte e promover a regeneração do axônio através da abertura.

Transplante de Schwann células dentro de conduítes de PVDF-TrFE a ponte rato necrosante tocos de medula espinhal para promover a regeneração do axônio através da abertura

Neste artigo, fornecemos um método reprodutível para gerar e manter fatias organotípicas da medula espinhal de longo prazo transplantadas com células-tronco neurais como um modelo ex vivo para testar terapias de reposição celular.

Cultura de fatias organotípicas da medula espinhal de camundongo de longo prazo como plataforma para validação de transplante de células em lesão medular

Neste estudo, foram desenvolvidos e caracterizados hidrogéis compostos miméticos de nervos que podem ser utilizados para investigar e capitalizar o comportamento pró-regenerativo de células-tronco derivadas do tecido adiposo para reparo de lesões medulares.

Desenvolvimento de Terapêutica Combinatória para Lesão Medular usando Entrega de Células-Tronco

O presente protocolo descreve o desenvolvimento de um modelo murino reprodutível de glioma medular por meio da injeção de células tumorais no espaço intervertebral, oferecendo uma abordagem mais eficaz e menos invasiva para pesquisa e desenvolvimento terapêutico.

Transplante cirúrgico de células tumorais na medula espinhal de camundongos

Aprenda o transplante de células precursoras neurais para o corno ventral cervical em modelos de ELA e lesão medular. Este protocolo detalhado permite proteger ou substituir neurônios motores frênicos disfuncionais em roedores.

Intra Transplante de Células de Segmentação Chifre Cervical Ventral em Esclerose Lateral Amiotrófica e lesão medular traumática

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