Uma técnica para avaliar a localização in vivo de anticorpos específicos do tumor

Tome uma suspensão de células de câncer de ovário humano. Adicione um meio de matriz de membrana basal e mantenha no gelo para evitar a formação de gel.

Coloque a mistura em uma seringa e injete por via subcutânea em um camundongo nu atímico. Remova a agulha assim que a matriz sofrer gelificação, evitando a expulsão da mistura.

A falta de uma resposta imune no camundongo imunodeficiente preserva a viabilidade das células injetadas. As proteínas da matriz extracelular do gel e os fatores de crescimento fornecem sinais promotores de crescimento, facilitando a formação de tumores.

As células tumorais superexpressam o receptor de folato alfa-1 ligado à superfície, ou FOLR1.

Tome anticorpos específicos para FOLR1. Adicione um corante fluorescente e incube, permitindo a conjugação do corante com os anticorpos.

Injete por via intravenosa os anticorpos marcados no camundongo anestesiado com tumor.

Os anticorpos atingem o tumor através da circulação e se ligam ao FOLR1 nas células tumorais, marcando fluorescentemente a superfície celular.

Realize imagens de fluorescência in vivo. Após a excitação, o corante emite fluorescência, facilitando a avaliação da localização do anticorpo no tumor.

Dialisar 0,5 mililitros do anticorpo usando um de diálise em 1 litro de tampão de conjugação. Após quatro horas, transfira o de diálise para um tampão novo e dialise durante a noite. Para configurar uma reação de conjugação, adicione 0,03 microgramas de IRDye 800CW por 1 miligrama de anticorpo em um volume total de 500 microlitros.

Incube a mistura por duas horas a 20 graus Celsius. Em seguida, purifique os conjugados marcados por diálise extensiva contra PBS. Estime o grau de marcação medindo a absorbância do corante em 780 nanômetros e a absorbância da proteína em 280 nanômetros.

Para desenvolver xenoenxertos de camundongo, levante suavemente a pele do animal e separe-a da camada muscular subjacente. Injete lentamente 100 microlitros de suspensão celular sob a pele com uma agulha de calibre 26. Aguarde alguns segundos antes de retirar a agulha para que o meio da matriz basal possa formar uma estrutura semelhante a um gel semi-sólido junto com as células sob a pele, o que impedirá que a mistura saia do local da injeção.

Para realizar imagens in vivo, injete o anticorpo marcado com corante através da veia da cauda. Depois de anestesiar o mouse, verifique a falta de resposta aos reflexos pediais e dilate a veia aplicando água morna. Use uma seringa de insulina de 1 CC com uma agulha de calibre 26 para injetar 25 microgramas do anticorpo marcado em um volume de 100 microlitros. Como controle negativo, rotule e injete o anticorpo do isotipo IgG não específico que não tem como alvo as células cancerígenas.

Realize imagens in vivo 8, 24 e 48 horas após as injeções de anticorpos. No software de imagem, clique em Inicializar. Confirme se a temperatura do estágio é de 37 graus Celsius. No painel de controle, configure a imagem de fluorescência por meio do assistente de imagem e defina a excitação para 773 nanômetros e a emissão para 792 nanômetros.

Transfira o mouse anestesiado para a câmara de imagem e posicione-o no campo de imagem usando o cone do nariz. Quando estiver pronto, clique em Adquirir no painel de controle para a aquisição da imagem e clique em Exposição automática. A imagem gerada é a sobreposição da fluorescência na imagem fotográfica, com intensidade de fluorescência óptica exibida em unidades de contagens ou fótons.