Um ensaio de clivagem de peptídeos fluorogênicos para rastrear a atividade proteolítica de proteases

Os vírus envelopados com proteínas spike transmembranares contêm um local de clivagem proteolítica.

As proteases ligadas à membrana nas células hospedeiras clivam as proteínas spike, expondo peptídeos de fusão que facilitam a entrada do vírus.

Para começar, pegue peptídeos do tipo selvagem com o local de clivagem canônico e peptídeos variantes, cada um com uma mutação única no local.

Os peptídeos fluorogênicos contêm um fluoróforo e um supressor. Devido à proximidade, o atenuador absorve a fluorescência do fluoróforo.

Pegue uma placa de vários poços no gelo, contendo tampão de ensaio e proteases hospedeiras.

Adicione os peptídeos do tipo selvagem e variantes em poços separados. Incubar a uma temperatura apropriada para uma atividade ideal de protease.

A protease cliva os peptídeos, separando o supressor do fluoróforo e permitindo sua emissão de fluorescência.

Meça a mudança no sinal de fluorescência para determinar a taxa de clivagem proteolítica.

Uma taxa mais alta para a sequência do tipo selvagem indica maior atividade proteolítica, enquanto uma taxa mais baixa para as variantes indica eficiência de clivagem alterada.

Prepare os tampões de ensaio apropriados para as proteases, c