Monitorando a chegada de proteínas de superfície marcadas com GFP à rede Trans-Golgi usando nanocorpos funcionalizados

Comece com células cancerígenas privadas de sulfato expressando uma proteína de superfície marcada com GFP.

Adicione sulfato radiomarcado e nanocorpos anti-GFP modificados - um anticorpo de cadeia única carregando um motivo de tirosina-sulfatação e incuba.

As células privadas de sulfato internalizam sulfatos radiomarcados, incorporando-os aos componentes celulares.

O nanocorpo anti-GFP se liga à proteína de superfície marcada com GFP e é endocitado em uma vesícula. Esta vesícula transporta o complexo proteico nanobody-surface ao longo de vias intracelulares específicas, incluindo a rede trans-Golgi, ou TGN.

Dentro do TGN, a sulfotransferase na presença de um substrato transfere um sulfato radioativo para resíduos específicos de tirosina no nanocorpo, marcando-o radiomarcando.

Lave as células. Em seguida, lise as células.

Centrifugue o lisado para remover grandes detritos celulares. Isole os nanocorpos usando um método de purificação baseado em esferas de níquel.

Carregue a fração isolada em um gel SDS-PAGE para separar o nanocorpo radiomarcado em bandas distintas.

Submeter o gel a autorradiografia.

A autorradiografia resultante revela regiões escurecidas, indicando a presença do na