Usando hibridização in situ de fluorescência de imuno-RNA para visualizar o SARS-CoV-2

Pegue células Vero infectadas por coronavírus fixas e permeabilizadas - uma linha celular de mamíferos com deficiência de interferon.

Dentro do hospedeiro, o RNA viral está presente como subgenômico ou sgRNAs, moléculas de RNA de comprimento intermediário que codificam proteínas virais específicas sintetizadas por meio de transcrição.

Adicione a reação em cadeia de hibridização ou sondas iniciadoras HCR.

A sonda HCR se liga à sua sequência complementar no RNA alvo.

Introduza sondas de grampo de oligonucleotídeos marcadas com fluorescência, H-1 e H-2.

A sonda iniciadora se liga à sua cauda H1 complementar, linearizando a estrutura do gancho de cabelo.

A sequência H1 exposta se liga à sua cauda H2 complementar.

A sequência H2 à direita continua se ligando a uma cauda H1, amplificando sondas marcadas com fluorescência ao redor da área-alvo e gerando um sinal robusto.

Adicione anticorpos apropriados para visualizar o citoesqueleto da célula hospedeira.

Manchar os núcleos usando DAPI.

Sob um microscópio de fluorescência, as células infectadas por vírus exibem fluorescência vermelha no citoplasma, indicando a presença do RNA alvo.

Depois de fixar e permeabilizar as células, conforme descrito no manuscrito do texto, remova a solução 1x PBS dos poços e adicione pelo menos 300 microlitros de tampão de amplificação a cada poço. Incubar as amostras durante 30 minutos à temperatura ambiente. Prepare cada grampo de cabelo HCR resfriando o volume desejado em tubos separados.

Para preparar 300 microlitros de solução de amplificação, use 18 picamoles de cada grampo de cabelo. Transfira a solução em grampo para tubos e incube-os a 95 graus Celsius por 90 segundos. Em seguida, deixe esfriar até a temperatura ambiente por 30 minutos no escuro. Prepare uma mistura de grampos de cabelo adicionando os grampos de cabelo H1 e H2 resfriados por pressão ao tampão de amplificação. Coloque gotas de 30 a 50 microlitros de mistura de grampo de cabelo no parafilme e incube as amostras durante a noite no escuro em temperatura ambiente.

Para montar as lâminas, coloque duas gotas de 10 microlitros de meio de montagem em uma lâmina, certificando-se de que as gotas estejam separadas o suficiente para permitir que duas lamínulas sejam colocadas em uma única lâmina. Remova o excesso de líquido batendo nas lamínulas em uma toalha limpa. Em seguida, coloque-os em um meio de montagem anti-desbotamento com as células voltadas para baixo. Coloque as amostras montadas em uma superfície plana e seca no escuro e deixe-as curar.