Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Imunologia
0 visualizações • 5:13 min. • July 8th, 2025
Comece com uma placa de vários poços contendo células dendríticas de camundongos, ou DCs carregando aloantígenos ou variantes genéticas de autoantígenos.
Introduza células T de camundongo, incluindo células T alorreativas que não são reativas a autoantígenos, enquanto reconhece antígenos estranhos.
As células T aloreativas reconhecem esses aloantígenos e interagem com DCs, desencadeando o rearranjo do citoesqueleto, incluindo a reorganização da F-actina.
Isso promove os receptores nas células T para se envolverem com moléculas co-estimulatórias nas DCs, formando uma conexão celular - uma sinapse imunológica.
Fixe as células, transfira-as para um tubo e introduza um coquetel de anticorpos marcados com fluorocromo específicos para células T e receptores DC, transmitindo fluorescência distinta.
Remova os anticorpos não ligados e ressuspenda as células em um tampão contendo um agente permeabilizante que permeabiliza as células e marcadores proteicos verdes marcados com fluoróforo que se ligam à F-actina.
Centrifugue e ressuspenda as células em um tampão contendo corante nuclear, corando os núcleos de vermelho.
Usando citometria de fluxo de imagem, identifique os dupletos - correspondentes aos conjugados de células T e DC com mira verde de F-actina - confirmando a formação de sinapses.
Quantifique os dupletos que representam o grau de aloreatividade.
Comece semeando 0,5 vezes 10 até a sexta célula dendrítica em cada poço de uma placa de cultura de células de 96 poços, seguida por 1 vezes 10 até a sexta célula T em um volume final de até 50 microlitros no total de meio de cultura por poço. Incube as culturas frias por quatro horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.
Em seguida, adicione três vezes o volume de cultura de formaldeído a 1,5% em PBS a cada poço por 30 minutos em temperatura ambiente. No final da fixação, transfira as células de cada poço para um tubo de poliestireno de 5 mililitros correspondente e cove as células com os anticorpos conjugados com fluorocromo apropriados em 100 microlitros de tampão de lavagem por 30 minutos em temperatura ambiente, protegido da luz.
Em seguida, lave as células em 1 mililitro de tampão de lavagem e ressuspenda os pellets em tampão de lavagem permanente contendo faloidina-FITC. Após mais 30 minutos em temperatura ambiente protegida da luz, lave as células em 1 mililitro de tampão de lavagem de permanente fresco. Ressuspenda os pellets no corante nuclear de interesse no tampão de lavagem permanente para uma incubação final de 30 minutos à temperatura ambiente protegida da luz e lave as células em 1 mililitro de tampão de lavagem permanente, seguido de uma lavagem apenas no tampão de lavagem. Em seguida, ressuspenda as células em 50 a 100 microlitros de tampão de lavagem fresco e transfira as células para tubos de microcentrífuga com tampa pequena.
Para analisar as interações célula a célula, primeiro reserve um canal para aquisição de imagem de campo claro e carregue o primeiro tubo de controle. Com o canal de campo claro desativado, na janela Área de trabalho, crie um novo gráfico de dispersão para cada canal usado com a taxa de proporção sobre a área e coloque os singlets onde a taxa de proporção é próxima a um.
Para cada fluorocromo, verifique a população positiva e ajuste a tensão do laser na caixa de iluminação conforme necessário. Na caixa Canais, selecione os canais apropriados para os fluorocromos usados na coloração. Em seguida, clique em Gravar. Quando o número de eventos atingir o limite especificado, a aquisição será interrompida automaticamente.
Depois que todos os controles de coloração única tiverem sido adquiridos, carregue o primeiro tubo de amostra experimental e adquira várias dezenas de milhares de eventos sob os canais de análise apropriados, incluindo o canal de campo claro.