Medindo a aloreatividade em uma população mista de células T

Comece com uma placa de vários poços contendo células dendríticas de camundongos, ou DCs carregando aloantígenos ou variantes genéticas de autoantígenos.

Introduza células T de camundongo, incluindo células T alorreativas que não são reativas a autoantígenos, enquanto reconhece antígenos estranhos.

As células T aloreativas reconhecem esses aloantígenos e interagem com DCs, desencadeando o rearranjo do citoesqueleto, incluindo a reorganização da F-actina.

Isso promove os receptores nas células T para se envolverem com moléculas co-estimulatórias nas DCs, formando uma conexão celular - uma sinapse imunológica.

Fixe as células, transfira-as para um tubo e introduza um coquetel de anticorpos marcados com fluorocromo específicos para células T e receptores DC, transmitindo fluorescência distinta.

Remova os anticorpos não ligados e ressuspenda as células em um tampão contendo um agente permeabilizante que permeabiliza as células e marcadores proteicos verdes marcados com fluoróforo que se ligam à F-actina.

Centrifugue e ressuspenda as células em um tampão contendo corante nuclear, corando os núcleos de vermelho.

Usando citometria de fluxo de imagem, identifique os dupletos - corresponden