Uma técnica de coloração de tetrâmero Peptide-MHC-I para analisar células T de memória CD8⁺ específicas para SIV

Pegue células mononucleares do sangue periférico de primatas não humanos, ou PBMCs, contendo células T de memória CD8 ⁺ contra o vírus da imunodeficiência símia ou SIV.

Adicione um inibidor de proteína quinase para evitar a internalização do receptor de células T, ou TCR, após estimulação subsequente.

Introduzir complexo de histocompatibilidade peptídeo maior classe I, ou tetrâmeros pMHC-I, complexos conjugados com fluoróforo compreendendo quatro moléculas de MHC-I ligadas a peptídeos específicos do SIV. Esses peptídeos se ligam a TCRs na superfície das células T.

Adicione uma mistura contendo anticorpos conjugados com fluoróforo que se ligam a CD8, CD28 e CCR7 - marcadores que delineiam subconjuntos de células T de memória - e anticorpos que marcam células não CD8 ⁺.

Um corante de viabilidade fluorescente rotula células mortas.

Corrija as células. Permeabilize-os para acessar alvos intracelulares.

Adicione anticorpos conjugados com fluoróforo que ligam CD3, um marcador de células T, e granzima B intracelular, um marcador de células T CD8 ⁺ ativado.

Usando citometria de fluxo, exclua células T não CD8⁺ e células mortas.

Gate células T CD8⁺ positivas para tetrâmero pMHC-I para carac