Uma coloração imuno-histoquímica para a detecção de antígenos do vírus da raiva

Comece com um slide carregando uma seção de tecido cerebral de camundongo infectado com vírus da raiva fixado em formalina e embebido em parafina. A seção fixa retém antígenos virais por meio de reticulação de proteínas.

Trate a lâmina com uma solução de xileno para remover a parafina.

Mergulhe a lâmina em concentrações decrescentes de etanol para reidratar o tecido, tornando-o compatível com soluções aquosas.

Introduza um tampão contendo protease para interromper as ligações cruzadas de proteínas, melhorando a acessibilidade do antígeno.

Mergulhe em peróxido de hidrogênio para bloquear as peroxidases endógenas e aplique uma solução de bloqueio para evitar interações inespecíficas.

Introduzir anticorpos primários específicos para o antígeno da raiva, formando complexos antígeno-anticorpo.

Adicione anticorpos secundários biotinilados, que se ligam aos anticorpos primários. Incubar com enzimas peroxidase conjugadas com estreptavidina, que interagem com a biotina.

Introduzir um substrato de peroxidase, produzindo um precipitado vermelho-magenta.

Contra-core o tecido com uma coloração nuclear, seguida por um agente azulado, corando os núcleos de azul.

A imagem imuno-histoquímica revela manchas vermelho-magenta no citoplasma, confirmando a presença de antígenos antirrábicos na seção tecidual.

Usando um micrótomo, faça uma seção de parafina de 5 micrômetros. Flutue a seção em banho-maria a 38 graus Celsius e colete-a em lâminas de vidro. Rotule as lâminas com uma caneta resistente a reagentes. Coloque as lâminas em uma bandeja e derreta em um forno a 55 a 60 graus Celsius por uma hora.

Em seguida, retire as lâminas do forno e desparafinize-as imediatamente com três enxágues consecutivos de xileno de cinco minutos cada. Depois disso, reidratar as seções na lâmina por imersões sequenciais em diluições decrescentes de etanol em água deionizada, conforme descrito no protocolo de texto.

Trate as lâminas com a protease por 30 minutos para recuperação do antígeno proteolítico, depois enxágue as lâminas em PBST por 10 minutos e trate-as com peróxido de hidrogênio a 3% por 10 minutos. Depois disso, lave as lâminas novamente com PBST por 10 minutos.

Para começar, remova uma lâmina do tampão, certificando-se de manusear apenas uma lâmina de cada vez, enquanto as outras permanecem submersas, e use uma toalha de papel para remover o excesso de tampo ao redor da seção de tecido. Coloque as lâminas em uma câmara de umidade e incube com soro de cabra normal em temperatura ambiente por 15 minutos.

Em seguida, incubar as lâminas na câmara de humidade com o anticorpo antirrábico primário de diluição pré-determinada ideal e anticorpos de controlo negativo à temperatura ambiente durante 60 minutos, sem lavagens entre eles. Depois disso, lave as lâminas com PBST por 10 minutos e incube em uma câmara de umidade com o anticorpo biotinilado em temperatura ambiente por 15 minutos.

Lave as lâminas novamente com PBST por 10 minutos. Incubar as lâminas em uma câmara de umidade com complexo estreptavidina-HRP à temperatura ambiente por 15 minutos e lavar o PBST por 10 minutos. Em seguida, incube com AEC em uma câmara de umidade em temperatura ambiente por 10 minutos. Lave as lâminas em água deionizada por 10 minutos e contra-core com hematoxilina de Gill diluída 1 a 2 com água deionizada por dois minutos.

Depois disso, enxágue o excesso de hematoxilina enxaguando as lâminas por imersão em água deionizada. Enxágue as lâminas em água da torneira Scott por 30 segundos e lave em água deionizada por 10 minutos. Remova as corrediças uma de cada vez e monte-as com meio de montagem solúvel em água. Em seguida, use um microscópio de luz para ler as lâminas.