Visualização baseada em microscopia TIRF da formação e fechamento de fagossomos

Pegue um prato de fundo de vidro revestido de polímero contendo glóbulos vermelhos opsonizados por IgG ou hemácias aderidas à sua superfície.

Coloque o prato em um microscópio de fluorescência de reflexão interna total stage, mantendo-o em temperatura fisiológica.

Adicione macrófagos contendo peptídeos citoplasmáticos marcados com fluorescência que se ligam à actina polimerizada, facilitando a visualização do citoesqueleto.

Durante a geração de imagens, direcione um feixe de laser em um ângulo superior ao ângulo crítico, causando reflexão interna e geração de ondas evanescentes no ponto de contato.

As ondas evanescentes iluminam seletivamente os fluoróforos na interface vidro-amostra, permitindo a visualização em tempo real da fagocitose.

Os receptores Fc de macrófagos se ligam às hemácias opsonizadas por IgG, causando agrupamento de receptores ao redor da área de contato.

O agrupamento desencadeia vias de sinalização intracelular e ativação de GTPase, impulsionando a polimerização da actina e o recrutamento de dinamina, formando pseudópodes.

Os pseudópodes se estendem ao redor das hemácias, formando uma taça fagocítica.

Eventualmente, as pontas dos pseudópodes se fundem. A dinamina acumulada medeia a separação do fagossomo da membrana celular, internalizando as hemácias opsonizadas.

Para fixação não covalente dos SRBCs, despeje 2 mililitros de células opsonizadas por IgG em cada um dos pratos revestidos de polilisina e centrifugue as amostras em uma centrífuga de rotor oscilante. Descarte os sobrenadantes e lave as partículas uma vez com 2 mililitros de PBS mais 10% de BSA.

Em seguida, incube as partículas com 2 mililitros de PBS fresco mais 10% de BSA por 30 minutos em temperatura ambiente, seguido de três lavagens com 2 mililitros de PBS. Após a última lavagem, substitua o PBS por 2 mililitros de meio de microscopia sem soro a 37 graus Celsius.

Coloque uma placa codificada SRBC na platina do microscópio. Em seguida, raspe as células transfectadas de interesse do fundo da placa de cultura e pipete as células algumas vezes para obter uma suspensão unicelular. Adicione as células transfectadas ao prato revestido com SRBC.

Inicie o software de aquisição ao vivo. Encontre uma célula que expresse as proteínas marcadas com fluorescência e ajuste a posição do prato para que uma célula de interesse fique no meio do campo. Adquira 500 imagens em diferentes ângulos de 0 a 5 graus em incrementos de 0,01 grau em um comprimento de onda de excitação.

Para determinar o ângulo crítico para que a luz incidente seja totalmente refletida na interface vidro-meio e gerar uma onda evanescente, abra a sequência de imagens no software de imagem apropriado. Selecione uma região de interesse na célula com fluorescência uniforme.

Em seguida, na guia Imagem, selecione Pilhas e plote o perfil do eixo Z. Para traçar o perfil do eixo Z, a intensidade média de fluorescência medida na região de interesse com a função dos ângulos no eixo X. Qualquer valor de ângulo no eixo x superior ao ângulo crítico pode então ser usado durante a sessão de microscopia para obter um sinal TIRF.