Name: Tecnologia IgY: Extração de anticorpos de gema de ovo de galinha por polietileno glicol (PEG) Precipitação (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Aprenda a extrair anticorpos IgY de gema de ovo de galinha usando precipitação com polietileno glicol. Este método simples e econômico é ideal para pesquisas em imunologia e biotecnologia.

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Este trabalho foi financiado por uma doação do Ministério Federal Alemão de Educação e Pesquisa (Projeto BiGRUDI [Bi ologische G efahrenlagen: R isikobewertung, u ltraschnelle D etektion und eu dentifizierung von bioterroristisch relevanten Agenzien, 13N9594]). Agradecemos a B. Diemar (Charité-Universitätsmedizin Berlim, Institut für Pharmakologie) para assistência técnica excelente.

1. Protocolo - IgY-extração por meio de PEG-precipitação Fig. 1 apresenta o esquema do processo de extração de IgY (ver Tabela 2). O protocolo foi descrita pela primeira vez em Polson et al. 1980. Todas as etapas devem ser executadas usando luvas de látex. <ol><li> A casca é cuidadosamente rachada ea gema é transferido para uma "colher de gema", a fim de remover o ovo muito branco quanto possível. </li><li> A gema é transferido para um papel de filtro e rolou para remover restantes clara de ovo, a gema, em seguida, a pele é cortada com uma lanceta ou um instrumento similar (pipeta ponta). A gema é colocada em um tubo de 50 ml eo volume de ovos está registrado (V1). </li><li> Duas vezes o volume de gema de ovo PBS é misturado com o (ΣV1 + V2) gema, PEG 6000 depois de 3,5% (em grama, pulverizado) do volume total é adicionado e agitadas, seguido por 10 min que rola em um misturador de rolamento. Essa etapa do procedimento de extração separa a suspensão em duas fases. Uma fase consiste em "sólidos gema e substâncias gordas" (citação original de Polson et al. 1980) e uma fase aquosa contendo proteínas IgY e outros. </li><li> Os tubos são centrifugados a 4 ° C por 20 min (10.000 rpm de acordo com a 13000 xg Heraeus Multifuge 3SR +, rotor ângulo fixo). O sobrenadante (V3) é filtrado através de um filtro dobrado e transferidos para um novo tubo. </li><li> PEG 6000 8,5% em grama (calculado de acordo com o novo volume) são adicionados ao tubo, agitadas e rolou em um misturador evolutivo como no passo 3. </li><li> Repita o passo 4 com a diferença que o sobrenadante é descartado. </li><li> O pellet é cuidadosamente dissolvidos em 1 ml de PBS, por meio de um bastão de vidro eo vortexer. PBS é adicionado a um volume final de 10 ml (V4). A solução é misturada com PEG 6000 12% (w / v, 1,2 grama) e tratados como no passo 3 (vortex, rolando). </li><li> Repita a etapa 6 e dissolver o sedimento cuidadosamente em 800 mL de PBS (vidro vara e vortex). Espere que as bolhas de ar para desaparecer e em seguida, transferir (pipeta) o extrato de uma cápsula de diálise. Lavar o tubo com 400 mL PBS e adicionar o volume para o dispositivo de diálise (V5). (Para a preparação de dispositivos de diálise e membranas ver anexo). </li><li> O extrato é dialisada durante a noite em solução salina 0,1% (1.600 ml) e agitado suavemente por meio de um agitador magnético. Na manhã seguinte, a solução salina é substituído por PBS e dialisado por mais três horas. </li><li> Posteriormente, o extrato de IgY é retirado da cápsula de diálise através de uma pipeta e transferidas para tubos de 2ml. O volume final é de cerca de 2 ml (V6). </li><li> O teor de proteína (mg / mL) das amostras é medida por fotometria em 280 nm (1:50 diluído com PBS) e calculado de acordo com a lei de Lambert-Beer, com um coeficiente de extinção de 1,33 para IgY (ver fig. 2), Fig. . 4 mostra a qualidade da preparação (pureza e recuperação são cerca de 80%). </li><li> É aconselhável para armazenar as amostras em alíquotas a -20 ° C (não congelar as amostras a -70 ° C). </li><li> A qualidade dos preparativos finais é analisada por SDS-PAGE simples como descrito no protocolo JOVE <a href="https://www.jove.com/details.php?id=1916">https://www.jove.com/details.php?id=1916</a> </li></ol> 2. Apêndice-antes de usar o saco de diálise deve ser preparado da seguinte maneira de acordo com as recomendações do fabricante: <ol><li> 20 sacos de diálise são cortadas em pedaços de 30 cm e dado num copo de vidro 2000 ml. </li><li> 1750 ml de 5 mM EDTA-solução são adicionados. </li><li> Um funil de vidro é colocado acima dos sacos para garantir que os sacos são cobertos pela solução de EDTA. A solução é aquecida e fervida por 5 min (placa quente). A solução é decantado e os sacos são lavadas três vezes com água destilada. </li><li> Mais uma vez 1750 ml EDTA-solução são adicionados, fervido por 5 min e lavadas três vezes com água destilada como acima. </li><li> Finalmente os sacos de diálise são fervidos por 10 min em água destilada e armazenado a 4 ° C. Tirar os sacos de diálise por meio de pinças esterilizadas. </li></ol> 3. Resultados representativos <img src="/files/ftp_upload/3084/3084fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Diagrama esquemático de IgY-extração por meio de precipitação de polietileno glicol de acordo com a descrição original de Polson et al. 1980. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3084/3084largefig1.jpg">Para ver uma imagem maior clique aqui.</a> <img src="/files/ftp_upload/3084/3084fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Desenvolvimento do total-IgY na gema de ovo de galinhas imunizadas na dependência de idade. Dado é a média semanal do total IgY / ovo e SD (n = 4 galinhas poedeiras). A partir de [Pauly et al. 2009]). <img src="/files/ftp_upload/3084/3084fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Layimonitoramento capacidade ng de quatro galinhas imunizadas com diferentes antígenos. As setas indicam data de vacinação (de [Pauly et al. 2009]). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3084/3084largefig3.jpg">Para ver uma imagem maior clique aqui.</a> <img src="/files/ftp_upload/3084/3084fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Poliacrilamida Gelelectrophoresis de preparações individuais IgY de ovos diferentes sob condições redutoras Pista 1 - marcador de peso molecular, Lane 2 - IgY-padrão, Lane 05/03 - IgY amostras diferentes preparado como descrito no protocolo. Estes são os últimos preparativos de acordo com o passo 10 do protocolo. HC - cadeias pesadas, LC - chaines luz,? - Impurezas menores correspondente ao peso molecular em torno de 35 kDa (provavelmente o fragmento C-terminal de vitelogenina precursor II, [Klimentzou et al, 2006.]). <table border="1"><tbody><tr><td> </td><td> Chicken 21 (A Antigen) </td><td> Chicken 22 (um antígeno) </td><td> Chicken 19 (B Antigen) </td><td> Chicken 23 (C Antigen) </td></tr><tr><td> Número de ovos (IgY total) 1, 2 anos-período </td><td> 625 (38 g) </td><td> 626 (38 g) </td><td> 545 (33 g) </td><td> 608 (37 g) </td></tr><tr><td> Número de ovos (IgY total), primeiro ano </td><td> 345 (20 g) </td><td> 304 (16 g) </td><td> 326 (18 g) </td><td> 308 (17 g) </td></tr><tr><td> Número de ovos (IgY total), segundo ano </td><td> 280 (18 g) </td><td> 322 (21 g) </td><td> 219 (15 g) </td><td> 300 (20 g) </td></tr><tr><td> % Do valor máximo. número de ovos possível (primeiro ano) 2 </td><td> 106 </td><td> 93 </td><td> 100 </td><td> 95 </td></tr><tr><td> % Do valor máximo. número de ovos possível (segundo ano) </td><td> 86 </td><td> 99 </td><td> 67 </td><td> 92 </td></tr><tr><td> número de ovos processados </td><td> 565 </td><td> 620 </td><td> 283 </td><td> 401 </td></tr></tbody></table> 1 A quantidade de IgY total é calculado pela multiplicação do número de ovos por um valor médio de 60 mg de proteína por ovo de acordo com os dados da Figura 2. O 2 max. número de ovos por ano é possível 325 de acordo com uma informação do criador. Tabela 1. Estatísticas Dois anos de capacidade de postura de ovos de galinhas imunizadas com diferentes antígenos. Deitado capacidade em por cento do máximo de quatro galinhas após a imunização com antígenos diferentes, bem como o resultado IgY durante dois anos (ver também a fig. 3), [Pauly et al. 2009]). <table border="1"><tbody><tr><td> Nr ovo. </td><td> Nr galinha. Deitado Data </td><td> V1 [ml] yolk </td><td> V2 [ml] PBS </td><td> 1. PEG prec. [G] </td><td> Vol [ml] após </td><td> 2. PEG prec. [G] </td><td> Pastilha </td><td> 3. PEG prec. [G] </td><td> Pastilha </td><td> Vol [ml] </td><td> Proteínas totais mg / ml </td><td> Corrigida de proteína total mg / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 2xV1 ΣV1 + V2 </td><td> 3,5% [w / v] ΣV1 + V2 </td><td> prec., centrif. V3 e filtração </td><td> 8,5% [w / v] V3 </td><td> dissolvido em PBS ml V4 </td><td> 12% [w / v] V4 </td><td> Dissolvido em PBS ml V5 </td><td> Após diálise contra PBS V6 </td><td> A280/ml </td><td> A280/ml: 1,33 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> H293 / 22,10. </td><td> 15 </td><td> 30 45 </td><td> 1,58 </td><td> 31 </td><td> 2,63 </td><td> 10 </td><td> 1,2 </td><td> 1,2 </td><td> 1,7 </td><td> 35,0 </td><td> 26,3 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> H293 / 23h10. </td><td> 13 </td><td> 26 39 </td><td> 1,37 </td><td> 25 </td><td> 2,12 </td><td> 10 </td><td> 1,2 </td><td> 1,2 </td><td> 1,7 </td><td> 28,8 </td><td> 21,6 </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Protocolo Exemplar de PEG precipitação

<ol><li>Akita, E. M., Nakai, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+four+purification+methods+for+the+production+of+immunoglobulins+from+eggs+laid+by+hens+immunized+with+an+enterotoxigenic+E.+coli+strain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of four purification methods for the production of immunoglobulins from eggs laid by hens immunized with an enterotoxigenic E. coli strain.</a> J. Immunol. Methods. 160, 207-214 (1993).</li>
<li>De Meulenaer, B., Huyghebaert, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+purification+of+chicken+egg+yolk+immunoglobulins%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Agricult.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Isolation and purification of chicken egg yolk immunoglobulins: a review.</a> Food Agricult. Immunol. 13, 275-288 (2001).</li>
<li>Klimentzou, P., Paravatou-Petsotas, M., Zikos, C. h, Beck, A., Skopeliti, M., Czarnecki, J., Tsitsilonis, O., Voelter, W., Livaniou, E., Evangelatos, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+immunochemical+evaluation+of+antibodies+Y+for+the+poorly%2C+immunogenic+polypeptide+prothymosin+alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Development and immunochemical evaluation of antibodies Y for the poorly, immunogenic polypeptide prothymosin alpha.</a> Peptides. 27, 183-193 (2006).</li>
<li>Pauly, D., Dorner, M., Zhang, X., Hlinak, A., Dorner, B., Schade, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+laying+capacity%2C+immunoglobulin+Y+concentration%2C+and+antibody+titer+development+in+chickens+immunized+with+ricin+and+botulinum+toxins+over+a+two-year+period%5BTitle%5D)+AND+%22Poultry+Science%22%5BJournal%5D)">Monitoring of laying capacity, immunoglobulin Y concentration, and antibody titer development in chickens immunized with ricin and botulinum toxins over a two-year period.</a> Poultry Science. 88, 281-290 (2009).</li>
<li>Polson, A., von Wechmar, M. B., van Regenmortel, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+viral+IgY+antibodies+from+yolks+of+immunized+hens%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Commun%22%5BJournal%5D)">Isolation of viral IgY antibodies from yolks of immunized hens.</a> Immunol. Commun. 9, 475-493 (1980).</li>
<li>Schade, R., Behn, I., Erhard, M., Hlinak, A., Staak, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchade%2C+R+%22Chicken+egg+yolk+antibodies%2C+production+and+application+%3A+IgY-Technology%22">Chicken egg yolk antibodies, production and application : IgY-Technology</a>. , Springer. Berlin. (2001).</li>
<li>Schade, R., Calzado, E. G., Sarmiento, R., Chacana, P. A., Porankiewicz-Asplund, J., Terzolo, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chicken+egg+yolk+antibodies+%28IgY-technology%29%3A+a+review+of+progress+in+production+and+use+in+research+and+human+and+veterinary+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Altern.+Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Chicken egg yolk antibodies (IgY-technology): a review of progress in production and use in research and human and veterinary medicine.</a> Altern. Lab Anim. 33, 129-154 (2005).</li>
<li>Witkowski, P. T., Bourquain, D. R., Hohn, O., Schade, R., Nitsche, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+gun-supported+DNA+immunisation+of+chicken+for+straightforward+production+of+poxvirus-specifiv+IgY+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Gene gun-supported DNA immunisation of chicken for straightforward production of poxvirus-specifiv IgY antibodies.</a> J. Immunol. Methods. 341, 146-153 (2009).</li>
</ol>

Experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pelo pêlo Landesamt Gesundheit und Soziales Berlin (H 0069/03).

A escolha de um método adequado de purificação de IgY é influenciado pela escala de purificação (laboratório ou industrial), a eficácia de custos, tecnologia (equipamentos de laboratório), eo impacto sobre o meio ambiente (gestão de resíduos). Vários métodos de extração IgY foram revistos em detalhe pelo De Meulenaer &amp; Huyghebaert (2001, para revisão ver também Schade et al. 2005). Em geral, estes métodos podem ser divididos em três grupos principais: <ol><li> Métodos de precipitação: envolvendo amônio ou sulfato de sódio, polietilenoglicol (PEG), ácido caprílico e caragenean. </li><li> Métodos cromatográficos: cromatografia de afinidade, cromatografia de troca iônica, cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia de interação thiophylic e gel-filtração cromatografia. </li><li> Ultrafiltração. </li></ol> A pureza de uma preparação IgY pode ser aumentada por uma combinação de métodos, por exemplo, PEG precipitação pode ser combinada com cromatografia de afinidade. Em alguns casos, dependendo da aplicação final, um extrato de água de IgY é suficiente para atingir bons resultados (Akita &amp; Nakai 1993). De acordo com nossa experiência, a IgY-amostra obtemos por PEG-precipitação funcionou muito bem em um monte de diferentes ensaios imunológicos. Ao padronizar o método PEG-precipitação um assistente técnico é capaz de processar cerca de 84 ovos por semana, o que corresponde a uma quantidade de IgY total entre 4 e 7 g por semana. Um cálculo simples: uma galinha poedeira é imunizados com um antígeno. Depois de um impulso imunizações poucos a galinha produz anticorpos específicos (Ab) com um título de 1:50.000 durante um período de 30 dias. 30 ovos x 2 ml IgY extract (ver protocolo e fig. 3) corresponde a 60 ml IgY total, que por sua vez corresponde a uma diluição Ab-de 3.000 l (a capacidade de um balde é 10 l), isso significa que com 3.000 l de solução de Ab 300 baldes podem ser preenchidos. Assim, em vista de tal enorme quantidade Ab-it não é problema para armazenar um Ab-pool de qualidade constante e especificidade. Esta técnica reduz a variabilidade de carga / lote de outra forma observado em poliespecífico Ab. Apesar do aspecto de quantidade, IgY Ab têm vantagens adicionais em comparação com IgG de mamíferos: Não ativação do sistema complemento em mamíferos, sem reatividade cruzada com HAMA (anticorpo anti rato humano), fatores reumatóide ou antígenos no sangue humano em grupo (falta de heteroagglutinins). Uma vantagem notável de IgY-Ab é a distância filogenética so-called. Distância filogenética é a razão para as diferenças freqüentemente descritos entre as especificidades Ab de mamíferos e aves, mesmo quando idêntica imunizados. Além das diferenças entre os mamíferos e do sistema imunológico das aves si, diferenças de desenvolvimento filogenético nestas duas classes de animais contribui para as diferentes especificidades Ab. Vários autores têm relatado que as galinhas produzem frequentemente Abs contra filogeneticamente altamente conservada de proteínas de mamíferos ou peptídeos com mais eficiência do que os coelhos (para revisão ver Schade et a. 2005). Como conseqüência, um antígeno conservada pode permanecer &quot;mascarados&quot; para o sistema imunológico de coelho, e, portanto, causar apenas um fraco ou uma resposta &quot;silenciosa&quot;. Além disso, se galinhas e coelhos são imunizados com o mesmo antígeno de mamíferos, muitas vezes os frangos respondem com uma especificidade Ab-que raramente pode ser alcançado em coelhos. Também o aspecto de bem-estar animal é importante, pois o Ab não-invasiva são extraídos de gema de ovo. Em combinação com Gene Gun-imunização (plasmídeo), o IgY-produção é totalmente não-invasiva (Witkowski et al. 2009). Em conclusão, a produção de Ab em galinhas e as IgY-extração por meio de PEG-precipitação é muito custo-efetiva e resulta em Ab altamente específicas com títulos estáveis ​​até 1:1.000.000. Devido à distância filogenética entre Aves e Mamíferos, frango são capazes de produzir Ab específica contra antígenos altamente conservada em mamíferos, em contraste com os coelhos, por exemplo. A extraordinária quantidade de Ab IgY obtidos por tecnologia abre as portas também para a utilização de IgY-Ab na medicina humana e veterinária para fins terapêuticos / profilático.

<ol><li> Dialyse Visking Bag, Tipo 27/32, corte -14 kD, Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Alemanha </li><li> Falcon tubos Blue Max, 50 ml de polipropileno tubo cônico, Becton Dickinson para laboratórios, Franklin Lakes NY, EUA </li><li> Dobrado Filtro MN 615 ¼, ∅ 150 mm, Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Alemanha Heraeus </li><li> Agitador magnético, Variomag Mono, H + P Labortechnik AG, Oberschleißheim, Alemanha </li><li> Micro-dialyse-Capsule 5,0 ml, Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Alemanha </li><li> Multifuge 3SR +, Thermo Scientific, Langenselbold, Alemanha </li><li> Fotômetro UV-160A, Shimadzu Deutschland GmbH, Duisburg, Alemanha </li><li> 6000 polietileno glicol, Rotipuran Ph. Eur., Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Alemanha </li><li> Pré-misturado PBS-Buffer 10x, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha </li><li> Rolo Mixer SRT2, Stuart, Staffordshire, UK </li><li> Vibrofix VF2, Janke &amp; Kunkel, IKA-Labortechnik, Staufen i.Br., Alemanha </li><li> Gema colher, Fackelmann (efeitos de uso doméstico), Alemanha </li></ol>

tecnologia igy: extração de anticorpos de gema de ovo de galinha por polietileno glicol (peg) precipitação

IgY Technology: Extraction of Chicken Antibodies from Egg Yolk by Polyethylene Glycol (PEG) Precipitation

Galinhas podem ser vacinadas, por meio de im vacinação (Musculus peitoral, esquerda e direita, o volume de injeção de 0,5-1,0 ml) ou por meio de Gene Gun-imunização plasmídeos. Dependente da imunogenicidade do antígeno, alto-anticorpo títulos (até 1:100.000 - 1:1.000.000) pode ser obtida após apenas uma ou 3-4 imunizações impulso. Normalmente, uma galinha põe ovos continuamente por cerca de 72 semanas, depois, a diminui a capacidade de postura. Este protocolo descreve a extração de IgY totais de gema de ovo, por meio de um processo de precipitação (PEG. Polson et al. 1980). O método envolve duas etapas importantes. O primeiro é a remoção de lipídios ea segunda é a precipitação de IgY totais do sobrenadante de um passo. Após diálise contra um buffer (normalmente PBS) o extrato de IgY-podem ser armazenadas a -20 ° C por mais de um ano. A pureza do extrato é de cerca de 80%, o total por IgY de ovos varia de 40-80 mg, dependendo da idade da galinha poedeira. Os aumentos IgY totais de conteúdo com a idade da galinha de cerca de 40 mg / ovo até 80 mg / ovo (PEG sobre precipitação). A capacidade de postura de uma galinha por ano é de cerca de 325 ovos. Isso significa que uma colheita total potencial de 20 g IgY total / ano, com base em um conteúdo IgY média de 60 mg total de ovos IgY / (ver Tabela 1).

Este protocolo descreve em particular o de extração de IgY totais de gema de ovo, por meio de precipitação polietileno glicol e dá informações gerais sobre a tecnologia IgY.

Tecnologia IgY: Extração de anticorpos de gema de ovo de galinha por polietileno glicol (PEG) Precipitação

As galinhas podem ser imunizadas por meio de vacinação i.m. (Musculus pectoralis, esquerdo e direito, volume de injeção de 0,5-1,0 ml) ou por meio de Gene-Gun...

Este vídeo mostrará o isolamento de anticorpos IGY de galinhas, que podem ser imunizadas com o gene gum, plasmídeo ou, de forma mais tradicional, por injeção intramuscular. Primeiro, a gema do ovo é isolada. Em seguida, os lipídios são precipitados, seguidos pela precipitação de uma fração proteica contendo os anticorpos, os quais são isolados em uma etapa adicional de precipitação.Por fim, os anticorpos são diálisados contra PBS. Sim. Olá. Meu nome é Ard. Aqui está minha colega, a Adema, e trabalhamos aqui no muito antigo e famoso Instituto de Farmacologia, que pertence à Medicina da Universidade SHA de Berlim.E a seguir, gostaríamos de mostrar a você a extração de IGY a partir de galinha, ovo, iogurte, e acreditamos que é um método muito, muito simples e também muito econômico. E, no conjunto, pertencemos à chamada tecnologia IGY. O primeiro passo na preparação do IGY é o isolamento da gema do ovo.Para este procedimento, precisamos de suportes para tubos, papel filtro com tampas azuis, ponteiras, tampão, um béquer de vidro, uma colher para separar a gema da clara do ovo e, é claro, os ovos. O ovo é quebrado sobre a colher para gema para drenar a clara. Em seguida, a colher contendo a gema é suavemente agitada para remover a maior parte da clara do ovo.A gema é então transferida para papel filtro para remover as proteínas da clara tão completamente quanto possível. A pele do ovo é muito estável em ovos com não mais de um mês após armazenamento superior a três meses. A pele da gema pode romper-se devido ao processo de envelhecimento durante a rolagem sobre o papel filtro.Posteriormente, a pele da gema é aberta com a ponta de uma pipeta e transferida para um tubo. Por fim, observa-se que a gema possui um volume de aproximadamente 15 mililitros. Esse volume é normal para uma galinha adulta em postura e varia apenas minimamente.O volume da gema é registrado. O polietilenoglicol a 3,5% é utilizado como precipitante em tampão PBS para separar as proteínas da gema, incluindo a IGY, dos lipídios presentes na gema do ovo. 1,58 grama de polietilenoglicol, correspondente a 3,5% do volume final da gema e do tampão, é pesado em uma balança. Os 15 mililitros de gema são misturados com o dobro do volume de tampão PBS, ou seja, 30 mililitros de PBS são adicionados, resultando em um volume final de 45 mililitros. O polietilenoglicol é então adicionado à mistura.O tubo é tampado e então vortexado completamente por 20 a 30 segundos. Inverta periodicamente o tubo. Durante o procedimento de vortexação.Após a agitação em vórtex, a gema deve estar completamente em suspensão. Os tubos são então colocados em um misturador rotativo durante 10 minutos. O resultado é uma mistura homogênea com mudança de cor de amarelo para amarelo claro.Agora, a mistura é centrifugada por 20 minutos. A centrifugação separa um sobrenadante claro, contendo IGY e outras proteínas, de um precipitado amarelo, que consiste principalmente em lipídios. Na próxima etapa, o sobrenadante S é despejado através de um filtro dobrado e transferido para um novo tubo.O novo volume é registrado e o precipitado é descartado. Agora, novamente, o polietilenoglicol é adicionado ao sobrenadante em uma concentração final de 12%, ou seja, 3,5% na primeira precipitação, mais 8,5% do volume resultante do SNAT, totalizando 12%. Em seguida, a solução é agitada, incubada em um misturador rotativo como antes e centrifugada por 20 minutos. Agora, o polietilenoglicol precipita a IgY e outras proteínas.Após esta etapa de centrifugação, o pellet será utilizado no preparo para dissolução. Os bastonetes de vidro do pellet são desinfetados com etanol 70%; enquanto os bastonetes secam, o sobrenadante S é descartado. O tubo é então invertido para drenar o restante do sobrenadante.Então, adiciona-se um mililitro de PBS ao precipitado. O precipitado é dissolvido utilizando o bastão de vidro, ao mesmo tempo em que se realiza uma vortexação completa. Agora você observa uma solução levemente amarelada.Agora, adiciona-se PBS até um volume final de 10 mililitros, seguido por uma terceira precipitação com polietilenoglicol na concentração de 12%, como anteriormente, em contraste com a segunda centrifugação. Desta vez, um precipitado branco é obtido após centrifugação por 20 minutos. O pellet é dissolvido da mesma forma que antes, mas em duas etapas.No primeiro passo, dissolve-se em 0,8 mililitros de PBS e transfere-se para uma cápsula de microdiálise. Em seguida, o tubo é lavado com mais 0,4 mililitros de PBS, que também são transferidos para a cápsula. Na etapa seguinte, um saco de diálise é cortado com tesoura desinfetada e lavado com água destilada.O saco de diálise é então colocado na parte inferior da cápsula e fechado firmemente pela parte superior. Por fim, as cápsulas são transferidas para um béquer de vidro colocado sobre um agitador magnético. A solução de IGY é submetida à diálise durante a noite contra solução salina 0,1%.No dia seguinte, a solução de IGY é diafiltrada durante três horas contra PBS. Após a conclusão da diálise, a membrana de diálise é perfurada com a ponta de uma pipeta e a solução de IGY é removida e transferida para um tubo pequeno. O volume final é registrado.O produto final é uma solução límpida, que pode ser armazenada a menos 20 graus Celsius por vários anos. De acordo com nossa experiência, não armazene a preparação de IGY a menos 70 graus Celsius, pois observamos uma perda significativa de atividade nessa temperatura. Bem, esperamos ter conseguido convencê-lo de que a extração de IDY de a é um procedimento realmente simples e eficaz ao seguir nosso protocolo.O equipamento necessário é mínimo, e acreditamos que há uma boa relação entre esforço e benefício. Espero que esta publicação em vídeo o incentive a fazer bom uso do nosso protocolo e também da tecnologia, como eu farei. Obrigado.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Neste vídeo, demonstramos a imunoprecipitação baseada em anticorpos de fosfopeptídeos de uma mistura de peptídeos. Os fosfopeptídeos enriquecidos são concentrados a vácuo e armazenados para análise a jusante.

Enriquecimento de fosfopeptídeos: uma técnica de imunoprecipitação baseada em anticorpos para separar peptídeos fosforilados específicos de misturas complexas de peptídeos

Este vídeo demonstra um ensaio para purificar anticorpos monoclonais de fluido de cultura de células colhidas de células ovarianas de hamster chinês. Ele emprega uma resina de vidro porosa com proteína A imobilizada, que se liga à região Fc dos anticorpos na amostra, separando-os efetivamente dos contaminantes. O uso de um tampão de eluição de baixo pH enfraquece a interação, facilitando a recuperação de anticorpos purificados.

Uma técnica para purificar anticorpos monoclonais produzidos por células de ovário de hamster chinês

A identificação de moléculas associadas a regiões genômicas específicas de interesse é necessária para entender os mecanismos de regulação das funções dessas regiões. Este protocolo descreve procedimentos para realizar imunoprecipitação de cromatina mediada por molécula de ligação ao DNA (enChIP) projetada para identificação de proteínas e RNAs associados a uma região genômica específica.

O isolamento de regiões específicas genômico e identificação de moléculas pela Associated enChIP

A oligomerização do receptor de rianodina, um canal iônico homotetramérico que medeia a liberação de Ca2+ dos estoques intracelulares, é crítica para a contração do músculo esquelético e cardíaco. Aqui, apresentamos métodos complementares in vivo e in vitro para detectar a autoassociação de proteínas e determinar a estequiometria de homo-oligômero.

Abordagens genéticas e bioquímicas para<em&gt; In Vivo</em&gt; e<em&gt; In Vitro</em&gt; Avaliação de oligomerização da proteína: A Case Study rianodina Receptor

O método Tandem Affinity Purification (TAP) tem sido amplamente utilizado para isolar complexos nativos de extrato celular, principalmente eucariótico, para proteômica. Aqui, apresentamos um protocolo do método TAP otimizado para purificação de complexos nativos para estudos estruturais.

Purificação de Native Complexos de estudo estrutural usando um método Tag Tandem Affinity

Este método fornece um quadro para estudar a incorporação de ácidos graxos exógenos de fontes hospedeiras complexas em membranas bacterianas, particularmente Staphylococcus aureus. Para conseguir isto, os protocolos para o enriquecimento de partículas da lipoproteína da gema de ovo da galinha e do perfil de ácido gordo subseqüente de fosfolipídios bacterianos que utilizam a espectrometria maciça são descritos.

Isolação de partículas da lipoproteína da gema de ovo da galinha para o estudo da incorporação do ácido gordo do micróbio patogénico bacteriano em phospholipids da membrana

Este artigo relata um método simples para isolar as subcamadas perivitelline externas e internas de ovos de galinha, minimizando a alteração estrutural e otimizando a solubilização proteica de cada subcamado para análises proteômicas.

Separação Mecânica e Solubilização de Proteínas das Subcamadas Perivitelline Externas e Internas dos Ovos de Galinha

O padrão de glicosylation de um anticorpo determina seu desempenho clínico, assim persistem os esforços industriais e acadêmicos para controlar a glicosylation. Uma vez que as campanhas típicas de glicoengenia são tempo e trabalhoso, a geração de um protocolo rápido para caracterizar o impacto dos genes de glicosylação usando silenciamento transitório seria útil.

Glicoengenia de anticorpos rápidos em células de ovário de hamster chinês

Este protocolo descreve uma metodologia para a preparação de esferas de látex para ensaios utilizando anticorpos IgY para detecção de antígenos.

Padronização de um ensaio citométrico de esferas baseado em anticorpos contra gema de ovo

As interações proteína-proteína são importantes para elucidar a função das proteínas-alvo, e a co-imunoprecipitação (co-IP) pode facilmente confirmar os IBPs. Transfectamos transitoriamente um plasmídeo que codifica uma proteína marcada com epítopo em células HEK-293 e desenvolvemos um método de imunoprecipitação para confirmar facilmente a ligação de duas proteínas-alvo.

Imunoprecipitação com um gel de afinidade anti-epítopo para estudar interações proteína-proteína

Aprenda a extrair anticorpos IgY de gema de ovo de galinha usando precipitação com polietileno glicol. Este método simples e econômico é ideal para pesquisas em imunologia e biotecnologia.

Tecnologia IgY: Extração de anticorpos de gema de ovo de galinha por polietileno glicol (PEG) Precipitação

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