Análise em tempo real da migração de células T residentes em diferentes regiões tumorais usando microscopia confocal
JoVE Encyclopedia of Experiments
Imunologia
0 vistas • 4:23 min • July 8th, 2025
Comece com uma fatia de tumor de pulmão contendo células T residentes.
As células T migram através do microambiente tumoral e interagem com células tumorais e elementos estromais, desempenhando funções imunológicas.
A composição do microambiente tumoral influencia fortemente o deslocamento e a velocidade das células T.
Adicione anticorpos imunofluorescentes distintos para marcar células T, células tumorais e elementos estromais no microambiente.
Adicione DAPI, que se infiltra nas células com uma membrana plasmática danificada para manchar o núcleo, permitindo a visualização de regiões necróticas dentro do tumor.
Observe a amostra corada em um microscópio confocal.
Usando uma luz de fluorescência adequada, selecione uma região tumoral de interesse contendo células T residentes. Avalie a viabilidade celular avaliando células positivas para DAPI.
Para análise em tempo real, defina intervalos de tempo e tempo total de gravação.
Para capturar imagens de pilha z, comece em uma profundidade abaixo das células T rotuladas e capture imagens em vários intervalos de tempo.
Utilize o software de rastreamento para comparar o comprimento do deslocamento das células T e a velocidade média em diferentes regiões do tumor.
Diluir os anticorpos marcados com fluorescência necessários e o corante nuclear de fluorescência, DAPI, até as concentrações finais necessárias em meio RPMI sem vermelho de fenol. Em seguida, remova a placa de cultura da incubadora e, usando uma ponta fina, aspire o líquido dentro das arruelas de aço inoxidável.
Agora, sem tocar na fatia, adicione 40 microlitros dos anticorpos diluídos em cada fatia do tumor. Para permitir a coloração, incube a placa a 37 graus Celsius por 15 minutos. Após a conclusão da etapa de coloração, usando uma pinça fina, remova as arruelas. Em seguida, retire delicadamente as fatias e mergulhe-as em meio RPMI1640 sem vermelho de fenol por 10 segundos. Coloque as fatias de volta nas inserções de cultura de células e adicione uma gota de meio RPMI1640 sem vermelho de fenol sobre cada fatia. Incubar a placa a 37 graus Celsius durante 10 minutos e depois proceder à obtenção de imagens.
Várias horas antes de iniciar este experimento, ajuste a temperatura da câmara de calor do microscópio para 37 graus Celsius e, em seguida, prepare o microscópio configurado para perfundir constantemente fatias de tumor com meio RPMI sem vermelho de fenol oxigenado e aspirar a solução para um frasco de coleta de resíduos usando uma bomba peristáltica.
Com a ajuda de uma pinça fina, retire a fatia manchada da placa de seis poços e transfira-a para uma placa de plástico de 35 milímetros cheia de meio RPMI sem vermelho de fenol e, em seguida, coloque uma âncora de fatia sobre a fatia para apoiá-la. Em seguida, coloque esta placa de Petri no estágio de imagem do microscópio.
Depois de conectar as pontas de entrada e saída do sistema de perfusão, ligue a bomba peristáltica para permitir que o meio oxigenado passe pelos tubos de perfusão. Abaixe a objetiva de imersão em água até a fatia e concentre-se na parte superior da fatia com luz de campo claro ou com o comprimento de onda apropriado.
Em seguida, usando filtros apropriados, visualize e selecione uma região de interesse que contenha todas as células de interesse marcadas com fluorescência, ou seja, as células T CD8, as ilhotas tumorais e as células estromais CD90-positivas. Configure uma sessão de imagem usando intensidade de laser e tempos de exposição apropriados para se adequar ao brilho dos sinais fluorescentes observados. Em seguida, configure a espessura da pilha Z para obter imagens dentro da fatia do tumor.
Em seguida, selecione o intervalo de tempo da imagem Z-stack e o tempo total de gravação para capturar imagens em intervalos de tempo específicos. Depois de capturar e exportar as imagens fluorescentes, analise a migração de células T CD8 conforme descrito no protocolo de texto.
Visão Geral
Este estudo investiga a dinâmica da migração de células T em fatias de tumor pulmonar, com foco em suas interações com células tumorais e o microambiente circundante. A metodologia envolve marcação fluorescente e microscopia confocal para visualizar o comportamento das células T em tempo real.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Imunologia
- Oncologia
- Biologia Celular
Contexto
- Os linfócitos T desempenham um papel crucial na resposta imune contra tumores.
- O microambiente tumoral afeta significativamente o comportamento dos linfócitos T.
- Compreender a dinâmica dos linfócitos T pode orientar estratégias de imunoterapia contra o câncer.
- A marcação fluorescente permite a observação detalhada das interações celulares.
Objetivo do Estudo
- Analisar os padrões de migração de linfócitos T dentro de tumores pulmonares.
- Avaliar o impacto do microambiente tumoral sobre o deslocamento e a velocidade dos linfócitos T.
- Utilizar técnicas de imagem avançadas para observação em tempo real.
Métodos Utilizados
- Preparação de fatias de tumor pulmonar com linfócitos T residentes.
- Marcação fluorescente de linfócitos T, células tumorais e elementos estromais.
- Microscopia confocal para obtenção de imagens e análise da dinâmica celular.
- Software de rastreamento para avaliar o deslocamento e a velocidade dos linfócitos T.
Resultados Principais
- A imagem em tempo real revelou padrões distintos de migração dos linfócitos T.
- O microambiente tumoral influenciou a velocidade e o deslocamento dos linfócitos T.
- A marcação fluorescente destacou efetivamente as regiões necróticas e as interações celulares.
- A análise de dados forneceu insights sobre o comportamento dos linfócitos T em diferentes regiões tumorais.
Conclusões
- O estudo aprimora a compreensão da dinâmica das células T em tumores pulmonares.
- As descobertas podem contribuir para o desenvolvimento de imunoterapias direcionadas.
- Técnicas de imagem em tempo real são valiosas para o estudo das respostas imunes em tumores.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A imagem confocal em tempo real da migração de linfócitos T CD8 residentes em fatias de tumor pulmonar humano fornece informações acionáveis sobre a dinâmica das células imunes no microambiente tumoral. Essa capacidade permite a desmistificação mecanicista e a validação de alvos para programas de imuno-oncologia, apoiando a confiança preditiva na interface entre descoberta e translação. Métricas quantitativas de migração orientam decisões do portfólio ao esclarecer o engajamento imune e as barreiras microambientais.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Permite a investigação direta das interações entre linfócitos T e tumor, e entre linfócitos T e estroma, in situ.
- Apóia a validação funcional de alvos mediante a quantificação do deslocamento e da velocidade dos linfócitos T.
- Oferece desvio mecanicista de riscos para alvos imunomoduladores em contextos teciduais complexos.
- Facilita a confiança preditiva em hipóteses de ativação imunológica.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Estabelece sistemas validados de fatias tumorais ex vivo para ensaios de migração de células imunes em etapas subsequentes.
- Fornece leituras quantitativas reprodutíveis da motilidade de células T em diferentes regiões tumorais.
- Permite a padronização de fluxos de trabalho de imagem e análise para o rastreamento de células imunes.
- Apoia a triagem de compostos ou biológicos que modulam a migração de células imunes.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha métricas de migração de células imunes com microambientes tumorais humanos relevantes para a doença.
- Conecta descobertas de pesquisa à validação pré-clínica, mantendo a arquitetura tecidual e a heterogeneidade.
- Informa o avanço ajustado ao risco de ativos em imuno-oncologia com base em leituras funcionais do sistema imune.
- Apoia o desenvolvimento de biomarcadores translacionais para infiltração e atividade de células imunes.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este fluxo de trabalho de imagem e análise integra desde a descoberta inicial até a pesquisa translacional, permitindo testes iterativos de hipóteses e redução de riscos mecanicistas em pipelines de imuno-oncologia.
- Biologia da Descoberta: Quantifica a migração de células T e sua interação com compartimentos tumorais e estromais para esclarecimento de vias.
- Triagem Fornece ensaios padronizados e quantitativos de migração para moduladores de células imunes.
- Análise de dados: Gera métricas de deslocamento e velocidade para comparação estatística robusta entre regiões tumorais.
- Pesquisa Translacional Mantém o contexto do tecido humano para continuidade pré-clínica e alinhamento de biomarcadores.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma reutilizável ex vivo para estudos de migração de células imunes em múltiplos programas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista no direcionamento de células imunes.
- Valor Operacional: Fornece fluxos de trabalho padronizados e reproduzíveis de imagem e análise para estudos de migração imune.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de prosseguir/interromper e alocação de capital ao esclarecer o envolvimento imune em tecido tumoral humano.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de ativos de imuno-oncologia com base em métricas imunes funcionais.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em microscopia confocal e manipulação de tecidos vivos.
- Exige acesso a plataformas avançadas de imagem e software de rastreamento.
- Necessita padronização entre equipes dos protocolos de coloração, aquisição de imagens e análise.
- Pode ser necessária adaptação para diferentes tipos de tumores ou populações de células imunes.
- A viabilidade e a qualidade do tecido podem limitar a reprodutibilidade e a interpretabilidade do ensaio.
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Última atualização: 29 agosto 2026