Análise em tempo real da migração de células T residentes em diferentes regiões tumorais usando microscopia confocal

Comece com uma fatia de tumor de pulmão contendo células T residentes.

As células T migram através do microambiente tumoral e interagem com células tumorais e elementos estromais, desempenhando funções imunológicas.

A composição do microambiente tumoral influencia fortemente o deslocamento e a velocidade das células T.

Adicione anticorpos imunofluorescentes distintos para marcar células T, células tumorais e elementos estromais no microambiente.

Adicione DAPI, que se infiltra nas células com uma membrana plasmática danificada para manchar o núcleo, permitindo a visualização de regiões necróticas dentro do tumor.

Observe a amostra corada em um microscópio confocal.

Usando uma luz de fluorescência adequada, selecione uma região tumoral de interesse contendo células T residentes. Avalie a viabilidade celular avaliando células positivas para DAPI.

Para análise em tempo real, defina intervalos de tempo e tempo total de gravação.

Para capturar imagens de pilha z, comece em uma profundidade abaixo das células T rotuladas e capture imagens em vários intervalos de tempo.

Utilize o software de rastreamento para comparar o comprimento do deslocamento das células T e a velocidade média em diferentes regiões do tumor.

Diluir os anticorpos marcados com fluorescência necessários e o corante nuclear de fluorescência, DAPI, até as concentrações finais necessárias em meio RPMI sem vermelho de fenol. Em seguida, remova a placa de cultura da incubadora e, usando uma ponta fina, aspire o líquido dentro das arruelas de aço inoxidável.

Agora, sem tocar na fatia, adicione 40 microlitros dos anticorpos diluídos em cada fatia do tumor. Para permitir a coloração, incube a placa a 37 graus Celsius por 15 minutos. Após a conclusão da etapa de coloração, usando uma pinça fina, remova as arruelas. Em seguida, retire delicadamente as fatias e mergulhe-as em meio RPMI1640 sem vermelho de fenol por 10 segundos. Coloque as fatias de volta nas inserções de cultura de células e adicione uma gota de meio RPMI1640 sem vermelho de fenol sobre cada fatia. Incubar a placa a 37 graus Celsius durante 10 minutos e depois proceder à obtenção de imagens.

Várias horas antes de iniciar este experimento, ajuste a temperatura da câmara de calor do microscópio para 37 graus Celsius e, em seguida, prepare o microscópio configurado para perfundir constantemente fatias de tumor com meio RPMI sem vermelho de fenol oxigenado e aspirar a solução para um frasco de coleta de resíduos usando uma bomba peristáltica.

Com a ajuda de uma pinça fina, retire a fatia manchada da placa de seis poços e transfira-a para uma placa de plástico de 35 milímetros cheia de meio RPMI sem vermelho de fenol e, em seguida, coloque uma âncora de fatia sobre a fatia para apoiá-la. Em seguida, coloque esta placa de Petri no estágio de imagem do microscópio.

Depois de conectar as pontas de entrada e saída do sistema de perfusão, ligue a bomba peristáltica para permitir que o meio oxigenado passe pelos tubos de perfusão. Abaixe a objetiva de imersão em água até a fatia e concentre-se na parte superior da fatia com luz de campo claro ou com o comprimento de onda apropriado.

Em seguida, usando filtros apropriados, visualize e selecione uma região de interesse que contenha todas as células de interesse marcadas com fluorescência, ou seja, as células T CD8, as ilhotas tumorais e as células estromais CD90-positivas. Configure uma sessão de imagem usando intensidade de laser e tempos de exposição apropriados para se adequar ao brilho dos sinais fluorescentes observados. Em seguida, configure a espessura da pilha Z para obter imagens dentro da fatia do tumor.

Em seguida, selecione o intervalo de tempo da imagem Z-stack e o tempo total de gravação para capturar imagens em intervalos de tempo específicos. Depois de capturar e exportar as imagens fluorescentes, analise a migração de células T CD8 conforme descrito no protocolo de texto.