Um ensaio baseado em células para avaliar a captação da proteína tau pela microglia

Comece com uma placa de fundo plano contendo microglia murina aderida - células fagocíticas no cérebro.

Introduzir um meio isento de soro contendo imunocomplexos. Esses complexos consistem em anticorpos ligados a agregados de proteínas Tau fosforiladas, que são formados durante certas doenças neurodegenerativas.

Os agregados Tau são marcados com um corante fluorescente verde sensível ao pH.

Durante a incubação, esses imunocomplexos interagem com os receptores Fc das células microgliais, facilitando seu engolfamento.

Este endossomo contendo imunocomplexo se funde com um lisossomo, formando um endolisossomo. O ambiente ácido do endolisossomo faz com que as moléculas do corante fiquem fluorescentes.

Lave para remover os imunocomplexos não internalizados.

Trate com solução de tripsina-EDTA para separar as células.

Transfira a suspensão celular para uma placa inferior em U posicionada sobre o gelo para estabilizar o endolisossomo. Pulverize as células e descarte o sobrenadante.

Lave e ressuspenda as células com tampão FACS.

Usando FACS, identifique as células vivas individuais e quantifique a intensidade de fluorescência verde para avaliar a captação de Tau pela microglia.

No primeiro dia do experimento, prepare as células BV-2 lavando-as primeiro com 1x PBS no frasco em que foram cultivadas. Em seguida, incube-os com 0,05% de tripsina EDTA a 37 graus Celsius e 5% de CO₂ até que se desprendam do frasco. Ressuspenda as células no meio de cultura pipetando para cima e para baixo 3 a 5 vezes.

Contar as células e preparar uma suspensão celular com uma concentração final de 100.000 células por mililitro em meio de cultura contendo 200 microgramas por mililitro de heparina. Adicione 250 microlitros desta suspensão celular por poço em uma placa de fundo plano de cultura de tecidos de 96 poços. Incube a placa a 37 graus Celsius com 5% de CO₂ durante a noite.

Depois de descongelar os agregados de corante de pH-Tau previamente preparados no gelo, dilua-os em 65 microlitros por condição de meio livre de soro para fazer uma solução de 500 nanomolares. Dilua os anticorpos em 65 microlitros de meio livre de soro para atingir o dobro da concentração desejada. Misture agregados de corante de pH-Tau e anticorpos em uma placa de fundo em U de 96 poços. Fechar esta placa de diluição e incubar durante a noite a 37 graus Celsius.

No dia seguinte, remova o meio da placa de 96 poços com células BV-2. Lave as células em cada poço com 100 microlitros de temperatura ambiente 1x PBS. Remova o PBS da placa celular BV-2. Use uma pipeta multicanal para transferir 125 microlitros de imunocomplexos da placa de diluição para cada poço de uma placa de células BV-2 de 96 poços e incube por duas horas a 37 graus Celsius com 5% de CO₂.

Após a incubação, remova os imunocomplexos das células e lave as células em cada poço com 100 microlitros de temperatura ambiente 1x PBS. Após remover o 1x PBS, adicione 50 microlitros de tripsina-EDTA a 0,25% e incube por 20 minutos a 37 graus Celsius com 5% de CO₂. Depois disso, adicione 200 microlitros de meio de cultura e ressuspenda o poço pipetando para cima e para baixo para separar as células.

Transfira as células para uma placa de fundo em U de 96 poços e centrifugue-a a 400 vezes g por 5 minutos a 4 graus Celsius. Coloque o prato no gelo e retire o meio. Adicione 150 microlitros de 1x PBS gelado e centrifugue novamente a 400 g por 5 minutos a 4 graus Celsius. Coloque o prato no gelo e lave novamente removendo 1x PBS adicionado anteriormente e adicionando 150 microlitros de PBS gelado por poço. Centrifugue novamente nas mesmas condições.

Coloque a placa no gelo e lave as células removendo o PBS adicionado anteriormente e adicionando 150 microlitros de tampão FACS por poço. Centrifugue novamente a 400 g por 5 minutos a 4 graus Celsius. Coloque a placa no gelo e remova o tampão FACS adicionado anteriormente e ressuspenda as células em um tampão FACS de 200 microlitros por poço. Prossiga imediatamente para a análise pelo FACS para adquirir 20.000 eventos na porta de célula ativa.