Ensaios biofísicos para investigar as propriedades mecânicas do núcleo da célula Interphase: Aplicação de substrato Strain e Manipulação de microagulhas

O objetivo geral dos experimentos a seguir é medir as propriedades mecânicas da interface entre o núcleo celular e sua conexão física com o citoesqueleto circundante. Isso é alcançado aplicando-se uma deformação mecânica a células cultivadas em uma membrana de silicone transparente e registrando as deformações nucleares induzidas. Deformações nucleares aumentadas correspondem a uma rigidez nuclear reduzida, já que alterações no acoplamento nucleo-citoesquelético também podem influenciar as deformações nucleares induzidas.

A transmissão de força intracelular entre o citoesqueleto e o núcleo é diretamente investigada mediante a aplicação de deformação localizada ao citoesqueleto. Em seguida, é realizada a imagem do deslocamento de estruturas nucleares NU e do citoesqueleto marcadas com fluorescência. São obtidos resultados que exibem a rigidez dos núcleos celulares em relação ao citoesqueleto circundante.

Com base nos experimentos de deformação do substrato, o ensaio de manipulação por microagulhas revela que a desorganização do acoplamento nucleocitoesquelético causa defeitos na transmissão de forças intracelulares. A principal vantagem dessas técnicas em relação a métodos existentes, como a aspiração por micropipeta de núcleos isolados, é que elas permitem a medição da mecânica nuclear em células vivas intactas, sem perturbar a arquitetura celular normal. Esses métodos podem fornecer informações sobre como alterações na composição da envoltória nuclear podem influenciar as propriedades mecânicas do núcleo.

Eles também podem ser aplicados para estudar o papel da mecânica nuclear no contexto de doenças como neuropatias LA ou câncer. Cada platina de alongamento consiste em um recipiente plástico personalizado sem fundo, com diâmetro de três polegadas, e um anel O de plástico para segurar uma membrana de silicone, que serve como substrato para cultivo celular. Para o preparo da platina de alongamento, prenda cuidadosamente um pedaço de membrana de silicone de quatro polegadas por quatro polegadas entre um anel O e o recipiente, corte o excesso de membrana, enxágue a platina com água desionizada e, em seguida, autocalefe o recipiente antes de revestir a membrana de silicone com moléculas da matriz extracelular; marque um ponto de referência na parte externa da membrana, no centro inferior.

Esta marca ajudará a identificar as mesmas células durante os experimentos de deformação para aplicação de deformação uniaxial. Duas faixas paralelas de fita adesiva são aplicadas ao redor do ponto de referência para restringir a formação da membrana em uma dimensão. Para proporcionar uma fixação celular ideal, revista as membranas de silicone com três microgramas por mililitro de fibronectina ou qualquer proteína da matriz extracelular adequada.

Cubra a placa de cultura com uma placa de poliestireno de 10 centímetros invertida e incube durante a noite a quatro graus Celsius no dia seguinte. Lave a membrana uma vez com PBS para remover o excesso de proteína. Preencha a placa com 10 mililitros de meio de crescimento e reserve.

Uma vez que o prato com membrana de silicone revestida tenha sido preparado, a tripsina olha as células com tripsina a 0,05% e semeia células aderentes no prato. Em meio de crescimento. Este procedimento é demonstrado com embriões de camundongo.

Fibroblastos ou mes incubam as células por 24 a 48 horas em condições normais de cultivo. Um microscópio invertido equipado para experimentos de tensão do substrato inclui um dispositivo de tensão composto por uma placa de base que se encaixa na platina do microscópio. A placa sustenta um cilindro central de platina, que serve para aplicar tensão à seção central da membrana de silicone.

O dispositivo também possui uma placa móvel que segura o recipiente de estiramento e pode deslizar para cima e para baixo em quatro pinos de orientação, bem como um peso de cinco libras para aplicar uma carga. Para visualizar os núcleos, incube as células no recipiente de estiramento com um micrograma por mililitro de corante hoechst por 15 minutos a 37 graus Celsius. Após a incubação, aspire o meio e substitua por 15 mililitros de meio de crescimento livre de vermelho de fenol com 25 milimolares de hepes.

Em seguida, parafuse a placa no suporte da placa e aplique cuidadosamente graxa ao longo do perímetro da parte inferior da membrana de silicone para garantir o deslizamento da membrana ao longo do platina central. Certifique-se de manter a seção central da membrana livre. Coloque a placa base sobre a platina do microscópio e monte cuidadosamente o suporte da placa sobre a placa base.

Certifique-se de que, na posição inicial de repouso, a membrana de silicone do recipiente de estiramento repouse folgadamente sobre o platina central. Em seguida, foque na parte inferior da membrana de silicone e localize o ponto de referência preto central. O ponto servirá como ponto inicial para todas as aquisições de imagem e auxiliará na localização das mesmas células durante e após o estiramento.

Nesta imagem, o ponto central preenche todo o campo de visão. A partir da borda do ponto, ajuste o foco para visualizar as células e o topo da membrana de silicone. Localize células bem espalhadas com núcleos centralmente posicionados.

Adquira uma imagem de contraste de face, que deve focar no contorno da célula e na membrana de silicone. Em seguida, adquira uma imagem de fluorescência da coloração do gancho nuclear nu, que deve focar no plano central do núcleo. Após adquirir imagens de cinco a 15 células, retorne ao ponto central.

Aplique lentamente o peso ao prato de tensão, resultando em uma aplicação uniforme de tensão no centro do prato. A tensão máxima aplicada ao substrato é limitada por espaçadores de náilon colocados nos pinos de alinhamento vertical após a aplicação da tensão; foque na parte inferior da membrana de silicone e localize novamente o ponto de referência, partindo do ponto.

Realoque as mesmas células e novamente adquira uma imagem de contraste de fase e o fim da imagem de fluorescência de cada célula no núcleo sob tensão total, tentando corresponder de perto os planos focais das imagens iniciais. Esse processo não deve exceder 10 minutos para evitar a remodelação ativa e a adaptação da célula ao substrato estranho. Após todas as imagens correspondentes terem sido adquiridas, mova a platina do microscópio de volta ao ponto inicial.

Remova cuidadosamente o peso da placa do suporte do recipiente e, se necessário, permita que a membrana de silicone relaxe. Empurre suavemente o recipiente de tensão até que ele retorne à posição inicial. Em seguida, adquira contraste de fase e fluorescência.

Imagens das células após a aplicação da deformação, conforme descrito para as imagens da deformação, imagens de células e núcleos marcados com fluorescência antes, durante e após a aplicação da deformação são analisadas para calcular a deformação nuclear normalizada. Nesta demonstração, um script personalizado escrito em MATLAB é utilizado para a análise, mas várias opções alternativas estão disponíveis para calcular manualmente a deformação aplicada ao substrato, comparando as posições de três a seis pontos de controle localizados na membrana entre as imagens correspondentes pré-deformação e pós-deformação. O programa MATLAB então calcula a deformação aplicada à membrana comparando as posições dos pontos de controle correspondentes entre as imagens pré-deformação e com deformação total.

As posições também são comparadas em relação à deformação residual entre as imagens pré-treinamento e pós-deformação. Os pontos de controle são simultaneamente utilizados para registrar os pares de imagens, o que ajudará a detectar células danificadas ou se destacando. Em seguida, selecione manualmente os núcleos usando um programa MATLAB separado que calcula a deformação nuclear para cada núcleo individual.

Isso é conseguido mediante o alinhamento do tamanho nuclear entre imagens fluorescentes pré e pós-deformação correspondentes ou pelo alinhamento de marcadores intranucleares para compensar pequenas variações na deformação aplicada à membrana entre diferentes experimentos. Os resultados são expressos como deformação nuclear normalizada. Isso é definido como a razão entre a deformação nuclear induzida e a deformação aplicada à membrana, calculada para cada núcleo.

Os scripts MATLAB estão disponíveis no laboratório lambing mediante solicitação. Como etapa final, cada núcleo é validado e as medições de células que se destacam ou ficam danificadas durante a aplicação da deformação são excluídas. MEFs espalhados por duas áreas distintas na membrana de silicone foram registrados por microscopia de contraste de fase e microscopia de fluorescência antes, durante e após a aplicação de uma deformação axial uniaxial de 20%. Aqui é apresentado um exemplo de um experimento bem-sucedido com núcleos válidos de células que sobreviveram à aplicação da deformação sem qualquer dano ou desprendimento.

Em contraste, as células mostradas aqui se retrairam ou se destacaram parcialmente durante a aplicação da deformação e são excluídas da análise. A célula no lado esquerdo apresenta sinais de dano ao citoesqueleto e colapso nuclear, enquanto a célula no lado direito se desprende parcialmente e se retrai durante a aplicação da deformação. Isso pode ser um indicativo de deformação excessiva.

Aqui, é apresentada uma análise da deformação nuclear normalizada em um painel de diferentes linhagens celulares de células metiladas de camundongos deficientes em Laminina AC que expressam ectopicamente ou um vetor vazio ou laminina A selvagem, em comparação com mitos de camundongos selvagens irmãos. A perda de expressão das proteínas da envoltória nuclear, Laminina AC, resulta em aumento da deformação nuclear normalizada. Isso indica uma diminuição na rigidez nuclear, que pode ser parcial ou totalmente restaurada pela reintrodução da Laminina A selvagem. Para se preparar para o experimento de manipulação com microneedles, incubar um prato de cultura celular de 35 milímetros com fundo de vidro com uma baixa concentração de fibronectina por duas horas a 37 graus Celsius. Após a incubação, lavar o prato duas vezes com HBSS e adicionar dois mililitros de meio de crescimento ao prato.

Em seguida, os fibroblastos embrionários de camundongo são tratados com tripsina 0,05% e semeados em meio de crescimento sobre uma placa com fundo de vidro revestido com fibronectina, em dois mililitros de meio de crescimento. Para obter células aderentes únicas não confluentes, coloque as células de volta no incubador durante a noite para coloração; adicione o corante mitocondrial MIT tracker e o corante nuclear ligado ao meio de crescimento. Adicione este meio de crescimento às células e prossiga com a incubação.

Em seguida, lave as células incubando-as em solução salina tamponada com Hank por cinco minutos à temperatura ambiente. Então, adicione meio de crescimento sem vermelho de fenol contendo 25 milimolar de HEPES às células para aquisição de imagens.

Para o experimento com microneedles, insira um microneedle previamente puxado em um micromanipulador acoplado a um microscópio invertido com um dispositivo digital acoplado à carga. Acople a câmera e foque o microneedle próximo a uma única célula. Adquira uma imagem da célula isolada sem a inserção do microneedle no citoplasma.

No contraste de fase, obtenha uma imagem fluorescente das ganchos 3 3, 3 4 2 e uma imagem fluorescente da coloração mitocondrial com objetivo de 60x em um microscópio invertido usando o micromanipulador, insira cuidadosamente a micropipeta no citoplasma de uma célula a uma distância fixa da periferia nuclear e capture uma imagem de contraste de fase, uma imagem fluorescente dos ganchos 3 3, 3 4, 2 e uma imagem fluorescente da coloração mitocondrial. Mova a micropipeta uma distância específica em direção à periferia celular a uma velocidade de um micrômetro por segundo, utilizando o micromanipulador controlado por computador, enquanto adquire automaticamente imagens a cada 10 segundos.

À medida que a microneedle se move a uma distância específica em direção à periferia celular, o micromanipulador deve ser controlado por meio de um computador para garantir uma micro-manipulação consistente. Os procedimentos finalmente adquirem imagens após a remoção da microneedle, e as imagens do citoesqueleto com características fluorescentemente marcadas do núcleo e do citoesqueleto, adquiridas antes, durante e após a manipulação com microneedle, são analisadas para calcular o deslocamento de pequenas regiões intracelulares. Nesta demonstração, utiliza-se um script personalizado escrito em MATLAB para análise, mas várias outras opções estão disponíveis.

O script MATLAB está disponível no laboratório Lambing mediante solicitação para medir o deslocamento gerado pelo microneedle. O programa MATLAB utiliza um algoritmo de correlação cruzada normalizada para calcular o deslocamento entre a posição original das estruturas marcadas com fluorescência e sua nova posição identificada. Os deslocamentos são então exibidos como mapas vetoriais e armazenados como valores numéricos.

O próximo passo é utilizar os mapas resultantes dos vetores de deslocamento para determinar os deslocamentos médios no citoplasma ou no núcleo com o matlab. Primeiro, selecione três ou mais pontos dentro do citoplasma no local de aplicação da deformação. No mapa de vetores de deslocamento, calcule o valor numérico médio para determinar a quantidade de deformação no citoplasma próxima ao local de aplicação gerada durante a utilização da microneedle.

Em seguida, selecione três ou mais pontos dentro do núcleo próximos ao local de aplicação da deformação e obtenha o valor médio. Esse valor representa a quantidade de deformação nuclear próxima ao local de aplicação da microneedle. Utilizando o mesmo método, determine as deformações nuclear e do citoesqueleto distantes do local de aplicação da deformação, a partir de pontos selecionados nessas regiões respectivas.

Um ensaio de manipulação com microagulhas foi realizado para medir a transmissão de força intracelular. Aqui são mostradas imagens de contraste de fase e imagens de fluorescência de um fibroblasto marcado com corante nuclear azul e corante mitocondrial verde MIT tracker. Uma microagulha foi inserida no citoesqueleto a uma distância definida do núcleo e posteriormente movida em direção à periferia celular.

O deslocamento mitocondrial foi prolongado antes, durante e após a tensão no citoesqueleto, e então os deslocamentos foram representados como vetores. Cada vetor representa o deslocamento calculado como a mudança entre a localização original e a posição recém-identificada. Regiões com baixa intensidade de imagem ou textura insuficiente foram excluídas da análise.

A displacão do citoesqueleto e do núcleo foi então quantificada em áreas selecionadas a distâncias crescentes do local de aplicação da deformação, tanto em fibroblastos controle quanto em fibroblastos. Em células com acoplamento nucleo-citoesquelético intacto, as forças são transmitidas por toda a célula, resultando em deformação induzida do núcleo e do citoesqueleto que diminui lentamente à medida que se afasta do local de aplicação da deformação. Em contraste, células com acoplamento nucleo-citoesquelético perturbado exibem deslocamento localizado próximo ao local de aplicação e apenas pequena deformação induzida em regiões mais distantes.

Aplica-se uma tensão citoesquelética comparável no local de inserção da microneedle em fibroblastos controle e em fibroblastos com acoplamento nucleo-citoesquelético interrompido. No entanto, os deslocamentos nucleares e citoesqueléticos induzidos em outras regiões foram significativamente menores nos fibroblastos com acoplamento nucleo-citoesquelético interrompido do que nas células controle. Assim, uma redução no deslocamento citoesquelético e nuclear distante do local de aplicação da tensão indica que a transmissão de força entre o citoesqueleto e o núcleo foi prejudicada.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como medir a mecânica nuclear e a transmissão de forças intracelulares entre o núcleo e o citoesqueleto. Você pode usar essas técnicas para estudar o efeito de mutações em proteínas do envelope nuclear ou alterações na composição do envelope nuclear que ocorreram durante o desenvolvimento ou em câncer.