Name: Ensaios biofísicos para investigar as propriedades mecânicas do núcleo da célula Interphase: Aplicação de substrato Strain e Manipulação de microagulhas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 27 s
Description: Aprenda a medir as propriedades mecânicas do núcleo celular e sua conexão com o citoesqueleto usando tensão de substrato e manipulação por microagulha. Estas técnicas permitem investigar a transmissão de forças intracelulares em células vivas aderentes.

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Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health (R01 e R01 HL082792 NS059348) e do Hospital Brigham and Women Award do Grupo de Liderança Cardiovascular.

<ol><li>Friedl, P., Wolf, K., Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+mechanics+during+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nuclear mechanics during cell migration.</a> Curr Opin Cell Biol. 23, 55-64 (2011).</li>
<li>Mejat, A., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LINC+complexes+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">LINC complexes in health and disease.</a> Nucleus. 1, 40-52 (2010).</li>
<li>Worman, H. J., Fong, L. G., Muchir, A., Young, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminopathies+and+the+long+strange+trip+from+basic+cell+biology+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Laminopathies and the long strange trip from basic cell biology to therapy.</a> J Clin Invest. 119, 1825-1836 (2009).</li>
<li>Caille, N., Tardy, Y., Meister, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+strain+field+in+endothelial+cells+subjected+to+uniaxial+deformation+of+their+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Assessment of strain field in endothelial cells subjected to uniaxial deformation of their substrate.</a> Ann Biomed Eng. 26, 409-416 (1998).</li>
<li>Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lamins+A+and+C+but+not+lamin+B1+regulate+nuclear+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Lamins A and C but not lamin B1 regulate nuclear mechanics.</a> J Biol Chem. 281, 25768-25780 (2006).</li>
<li>Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+nuclear+shape+and+impaired+mechanotransduction+in+emerin-deficient+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Abnormal nuclear shape and impaired mechanotransduction in emerin-deficient cells.</a> J Cell Biol. 170, 781-791 (2005).</li>
<li>Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lamin+A%2FC+deficiency+causes+defective+nuclear+mechanics+and+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Lamin A/C deficiency causes defective nuclear mechanics and mechanotransduction.</a> J Clin Invest. 113, 370-378 (2004).</li>
<li>Verstraeten, V. L., Ji, J. Y., Cummings, K. S., Lee, R. T., Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+mechanosensitivity+and+nuclear+stiffness+in+Hutchinson-Gilford+progeria+cells%3A+effects+of+farnesyltransferase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Increased mechanosensitivity and nuclear stiffness in Hutchinson-Gilford progeria cells: effects of farnesyltransferase inhibitors.</a> Aging Cell. 7, 383-393 (2008).</li>
<li>Brooks, S. V., Zerba, E., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injury+to+muscle+fibres+after+single+stretches+of+passive+and+maximally+stimulated+muscles+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Injury to muscle fibres after single stretches of passive and maximally stimulated muscles in mice.</a> J Physiol. 488, 459-469 (1995).</li>
<li>Maniotis, A. J., Chen, C. S., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstration+of+mechanical+connections+between+integrins%2C+cytoskeletal+filaments%2C+and+nucleoplasm+that+stabilize+nuclear+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Demonstration of mechanical connections between integrins, cytoskeletal filaments, and nucleoplasm that stabilize nuclear structure.</a> Proc Natl Acad Sci. 94, 849-854 (1997).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Ensaio de tensão substrato Aplicação cepa tem sido usada com sucesso por nós e outros grupos para estudar as deformações induzidas nuclear em células submetidas a estresse mecânico e investigar a contribuição das proteínas específicas envelope nuclear à rigidez nuclear. 08/04 A vantagem desta técnica é que ela sondas propriedades mecânicas núcleos de viver em seu ambiente normal celular e do citoesqueleto e que a aplicação tensão substrato assemelha-se a aplicação da carga fisiológic...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Fibronectina </td><td> Millipore </td><td> FC010 </td></tr><tr><td> MitoTracker Red FM e FM Verde </td><td> Invitrogen </td><td> M22425 e M-7514 </td></tr><tr><td> Hoechst 33342 </td><td> Invitrogen </td><td> H3570 </td></tr><tr><td> Saline Hank Sal Buffered </td><td> Invitrogen </td><td> 14185 </td></tr><tr><td> Livre de fenol, DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 21063 </td></tr><tr><td> Soro fetal bovino </td><td> Aleken Biologicals </td><td> FBSS500 </td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina </td><td> Sigma </td><td> P0781-100ML </td></tr><tr><td> Vidro borosilicato com filamento </td><td> Instrumento Sutter </td><td> BF100-78-10 </td></tr><tr><td> Gloss / folhas silicone Gloss não-reforçada, 0.005 &quot; </td><td> Especialidade Manufacturing Inc. </td><td></td></tr><tr><td> Phosphate Buffered Saline Dulbecco </td><td> Invitrogen </td><td> 14200 </td></tr><tr><td> 35 milímetros de vidro de fundo placas de cultura (FluoroDish) </td><td> Mundial Precision Instruments, INC </td><td> FD35-100 </td></tr><tr><td> Braycote graxa de vácuo 804 </td><td> Suprimentos Spi </td><td> 05133A-AB </td></tr></tbody></table>

ensaios biofísicos para investigar as propriedades mecânicas do núcleo da célula interphase: aplicação de substrato strain e manipulação de microagulhas

Biophysical Assays to Probe the Mechanical Properties of the Interphase Cell Nucleus: Substrate Strain Application and Microneedle Manipulation

Na maioria das células eucarióticas, o núcleo é a maior organela e é geralmente de 2 a 10 vezes mais duro do que o citoesqueleto redor e, conseqüentemente, as propriedades físicas do núcleo contribuir significativamente para o comportamento global biomecânica de células em condições fisiológicas e patológicas. Por exemplo, na migração de neutrófilos e invadindo as células cancerosas, rigidez nuclear pode representar um grande obstáculo durante o extravasamento ou passagem através de espaços estreitos dentro dos tecidos. 1 Por outro lado, o núcleo de células no tecido mecanicamente ativos, tais como o músculo requer suporte estrutural suficiente para suportar o estresse mecânico repetitivo. Importante, o núcleo é totalmente integrado à arquitetura celular, que está fisicamente ligado ao citoesqueleto circundante, que é um requisito essencial para o movimento intracelular e posicionamento do núcleo, por exemplo, em células polarizadas, núcleos sináptica nas junções neuromusculares, ou em células de migração. 2 Não é de surpreender que mutações em proteínas do envelope nuclear, como lamins e nesprins, que desempenham um papel crítico na determinação da rigidez nuclear e nucleo-citoesqueleto acoplamento, tem sido mostrado recentemente para resultar em uma série de doenças humanas, incluindo Emery- Dreifuss distrofia muscular, cinturas pélvica e escapular distrofia muscular e miocardiopatia dilatada. 3 Para investigar a função de diversas proteínas biofísicos envelope nuclear eo efeito de mutações específicas, desenvolvemos métodos experimentais para estudar as propriedades físicas do núcleo em um único, células vivas submetido a global ou localizada perturbação mecânica. Medição induzidos deformações nucleares em resposta ao pedido precisamente aplicado substrato tensão gera informações importantes sobre a deformabilidade do núcleo e permite a comparação quantitativa entre mutações diferentes ou linhas de células específicas para deficientes proteínas do envelope nuclear. Aplicação esforço localizado citoesqueleto com microagulhas é utilizado para complementar este ensaio e pode fornecer informações adicionais sobre a transmissão de força entre o núcleo intracelular e citoesqueleto. Estudar a mecânica nuclear em células vivas intactas preserva a arquitetura normal intracelular e evita artefatos potenciais que podem surgir quando se trabalha com núcleos isolados. Além disso, a aplicação tensão substrato apresenta um bom modelo para o estresse fisiológico experimentado por células em músculos ou outros tecidos (por exemplo, células musculares lisas vasculares expostos a tensão navio). Por último, enquanto que essas ferramentas têm sido desenvolvidas principalmente para estudar mecânica nuclear, eles também podem ser aplicados para investigar a função das proteínas do citoesqueleto e sinalização Mecanotransdução.

Nós apresentamos dois independentes, microscópio de ferramentas baseadas em medir as deformações induzidas nucleares e citoesqueleto em single, vivendo células aderentes em resposta à aplicação de tensão global ou localizada. Estas técnicas são utilizadas para determinar a rigidez nuclear (ou seja, deformabilidade) e para transmissão de força sonda intracelular entre o núcleo e citoesqueleto.

Ensaios biofísicos para investigar as propriedades mecânicas do núcleo da célula Interphase: Aplicação de substrato Strain e Manipulação de microagulhas

Na maioria das células eucarióticas, o núcleo é a maior organela e é tipicamente de 2 a 10 vezes mais rígido do que o citoesqueleto circundante; consequentemente, o ...

O objetivo geral dos experimentos a seguir é medir as propriedades mecânicas da interface entre o núcleo celular e sua conexão física com o citoesqueleto circundante. Isso é alcançado aplicando-se uma deformação mecânica a células cultivadas em uma membrana de silicone transparente e registrando as deformações nucleares induzidas. Deformações nucleares aumentadas correspondem a uma rigidez nuclear reduzida, já que alterações no acoplamento nucleo-citoesquelético também podem influenciar as deformações nucleares induzidas.A transmissão de força intracelular entre o citoesqueleto e o núcleo é analisada diretamente mediante a aplicação de uma deformação localizada ao citoesqueleto. Em seguida, são obtidas imagens do deslocamento de estruturas nucleares NU e do citoesqueleto marcadas com fluorescência. Os resultados obtidos demonstram a rigidez dos núcleos celulares em relação ao citoesqueleto circundante.Com base nos experimentos de deformação do substrato, o ensaio de manipulação por microagulhas revela que a interrupção do acoplamento nucleocitoesquelético causa defeitos na transmissão de forças intracelulares. A principal vantagem dessas técnicas em relação a métodos existentes, co

biophysical-assays-to-probe-mechanical-properties-interphase-cell

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Aqui nós descrevemos um método rápido e simples para medir a rigidez da célula. O princípio geral da presente abordagem é a de medir a deformação da membrana em resposta ao bem definido de pressão negativa aplicada por meio de uma micropipeta para a superfície celular. Este método fornece uma ferramenta poderosa para estudar as propriedades biomecânicas do substrato anexados células.

Aspiração micropipeta de Células-substrato anexados para Estimar Rigidez celular

Este documento revela um protocolo para caracterizar as propriedades mecânicas de células vivas por meio de microindentação utilizando um microscópio de força atómica (AFM).

Medir as propriedades mecânicas das células vivas Usando Microscopia de Força Atômica

Apresentamos neste artigo uma novela que se estende plataforma que pode ser usada para investigar as respostas das células individuais a complexa deformação mecânica biaxial anisotrópica e quantificar as propriedades mecânicas dos tecidos biológicos.

Uma plataforma Novel Alongamento para Aplicações em Celular e Tecidual mechanobiology

Descritos são protocolos para quantificar interações mecânicas entre células aderentes e substratos microestruturados. Essas interações estão intimamente ligadas a comportamentos celulares essenciais, incluindo migração, proliferação, diferenciação e apoptose. Os protocolos apresentam um software de análise de imagem de código aberto chamado MechProfiler, que permite a determinação das forças envolvidas para cada micropost.

Fácil e precisa Mecano-profiling em micropost Arrays

Neste protocolo, descrevemos um método de micropipeta para aplicar directamente uma força controlada para o núcleo de uma célula viva. Este ensaio permite interrogatório das propriedades mecânicas nucleares na célula viva, aderente.

Uma sonda de força direta para medir a integração mecânica entre o núcleo e o citoesqueleto

Usando um dispositivo projetado previamente para aplicar a tensão mecânica às pilhas aderentes, este papel descreve uma geometria redesenhada do substrato e um instrumento personalizado para a imagem latente da único-pilha de alta resolução de pilhas tensas com um objetivo da imersão do óleo 100x.

Imagem latente de alta resolução da dinâmica nuclear em pilhas vivos a tensão elástica uniaxial

Aqui, apresentamos um protocolo para investigar as propriedades mecânicas intracelulares de células isoladas de zebrafish em bidimensionais com medição direta de força por uma armadilha óptica.

Medições de força direta de mecânica subcelular em confinamento usando pinças ópticas

Apresentamos um método de injeção celular através da tecnologia de jato de água livre de agulhas, juntamente com uma sequência de investigações pós-entrega em termos de viabilidade celular, proliferação e medidas de elasticidade.

Injeção de células de stroma derivadas de tecido adiposo porcina através da tecnologia waterjet

Este estudo apresenta um novo protocolo para aplicar diretamente força mecânica no núcleo celular através de microesferas magnéticas entregues no citoplasma e para realizar imagens fluorescentes simultâneas de células vivas.

Combinando o Atuador de Força Magnética 3D e a Imagem de Fluorescência Multifuncional para Estudar a Mecanologia do Núcleo

Apresentamos aqui um método para fenótipo mecânico de células individuais usando uma plataforma microfluídica baseada em eletrônica chamada detecção de mechano-node-pore (mechano-NPS). Esta plataforma mantém um rendimento moderado de 1-10 células/s enquanto mede as propriedades biofísicas elásticas e viscosas das células.

Mechano-Node-Pore Sensing: Uma plataforma rápida e sem rótulos para medições viscoelásticas de célula única multiparâmetro

A exploração do comportamento celular sob estresse mecânico é fundamental para avanços na mecânica celular e mecanobiologia. Apresentamos a técnica de Fluorescence Micropipeette Aspiration (fMPA), um novo método que combina estimulação mecânica controlada com análise abrangente da sinalização intracelular em células únicas. Esta técnica investiga novos estudos aprofundados da mecanobiologia de células vivas.

Ensaio de Aspiração por Micropipeta de Fluorescência para Investigar Mecanosensing de Hemácias

Aprenda a medir as propriedades mecânicas do núcleo celular e sua conexão com o citoesqueleto usando tensão de substrato e manipulação por microagulha. Estas técnicas permitem investigar a transmissão de forças intracelulares em células vivas aderentes.

Ensaios biofísicos para investigar as propriedades mecânicas do núcleo da célula Interphase: Aplicação de substrato Strain e Manipulação de microagulhas (Vídeo) | JoVE Journal

Ensaios biofísicos para investigar as propriedades mecânicas do núcleo da célula Interphase: Aplicação de substrato Strain e Manipulação de microagulhas

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