Uma técnica de imunofluorescência de marcação dupla para visualizar proteínas do hospedeiro e do patógeno em uma célula infectada

Comece com células epiteliais fixas e permeabilizadas infectadas com um parasita patogênico.

Adicione um tampão de bloqueio para evitar a ligação de anticorpos não específicos.

Sobreposição com anticorpos primários policlonais de camundongo, interagindo especificamente com as proteínas do parasita.

Adicione anticorpos secundários marcados com fluoróforo vermelho distante que interagem com anticorpos primários ligados a proteínas parasitas.

Lave para remover anticorpos não ligados. Bloqueie com anticorpos anti-camundongo que se ligam a anticorpos primários, minimizando a reatividade cruzada durante a marcação da proteína hospedeira.

Adicione anticorpos primários monoclonais de camundongo direcionados às ribonucleoproteínas do hospedeiro dentro das células epiteliais.

Sobreposição com uma mistura de anticorpos secundários marcados com fluoróforo verde e faloidina conjugada com fluoróforo vermelho, facilitando a marcação de anticorpos primários ligados à proteína do hospedeiro e actina, respectivamente.

Lave com um tampão. Monte usando um meio contendo coloração de DNA, conferindo uma coloração azul ao núcleo do hospedeiro, núcleo do parasita e cinetoplasto.

Analise as amostras usando um microscópio confocal. A técnica de imunofluorescência de dupla marcação mostra proteínas verdes do hospedeiro e proteínas parasitas vermelhas, permitindo sua localização subcelular precisa.

Adicione as células LLC-MK2 em placas de 24 poços contendo lamínulas arredondadas esterilizadas por UV e deixe-as assentar por 16 horas. Em seguida, para infectar as células, adicione sobrenadante contendo T. cruzi a cada poço e incube por seis horas. Em seguida, lave as lamínulas contendo as células infectadas e não infectadas 5 vezes com PBS.

Em seguida, fixe as células com paraformaldeído a 2% e PBS. Após 10 minutos, lave as lamínulas três vezes por 5 minutos cada com PBS e, em seguida, permeabilize as lamínulas com detergente não iônico por 10 minutos.

Após três lavagens de PBS de 5 minutos, incubar as lamínulas em solução de bloqueio por 30 minutos, seguidas por outra incubação de 30 minutos com um anticorpo monoclonal ou policlonal de camundongo. Após as lavagens, incubar as lamínulas durante 30 minutos com anticorpo secundário em solução de bloqueio e faloidina para corar os filamentos de actina na célula hospedeira.

Em seguida, lave as lamínulas com PBS três vezes novamente antes de aplicar uma pequena quantidade de reagente de montagem anti-desbotamento com meio DAPI na superfície da lâmina. Usando uma pinça, incline suavemente a lamínula no meio para evitar a formação de bolhas.

Para rotulagem dupla, após incubar as lamínulas e a solução de bloqueio conforme demonstrado anteriormente, incubá-las no anticorpo policlonal de camundongo por 30 minutos. Em seguida, lave as lamínulas três vezes por 5 minutos cada com PBS antes de incubá-las com o anticorpo secundário por 30 minutos.

Em seguida, após três lavagens de PBS, execute uma segunda etapa de bloqueio com IgG anti-camundongo para coelhos AffiniPure diluída em solução de bloqueio. Após 30 minutos, lave as lamínulas com PBS novamente antes de incubá-las com o anticorpo monoclonal de camundongo por mais 30 minutos.

Em seguida, após três lavagens de PBS, incubar as lamínulas com anticorpo IgG2b anti-camundongo caprino e faloidina. Em seguida, após três lavagens de PBS, aplique o reagente de montagem antidesbotamento conforme demonstrado anteriormente.