Uma detecção baseada em matriz de peptídeos de aloanticorpos HLA anti-doadores em receptores de órgãos

Pegue uma matriz de peptídeos derivada do antígeno leucocitário humano de um doador de órgãos ou sequência HLA compreendendo diferentes peptídeos na membrana de celulose.

Cada peptídeo carrega pelo menos uma incompatibilidade de aminoácidos entre a sequência HLA do doador e do receptor, representando um epítopo potencial para rejeição de órgãos mediada por anticorpos.

Trate com um tampão de bloqueio para evitar a interação inespecífica de anticorpos.

Adicione o soro do receptor coletado após o transplante de órgãos, contendo aloanticorpos.

Esses anticorpos, formados contra o HLA do doador, ligam-se ao epítopo alvo.

Adicione um anticorpo secundário conjugado com peroxidase que se liga ao aloanticorpo.

Adicione substrato quimioluminescente e peróxido de hidrogênio. A peroxidase utiliza peróxido de hidrogênio para oxidar o substrato, emitindo luz.

Escaneie a membrana para obter uma imagem.

Adicione um tampão para remover os anticorpos ligados. Reprove com soro receptor pré-transplante e obtenha uma imagem.

Em comparação com a imagem pré-transplante, manchas escuras na imagem pós-transplante indicam epítopos HLA específicos do doador que incitam a reatividade de aloanticorpos.

Quando as matrizes tiverem sido sintetizadas, bloqueie as membranas com 20 mililitros de leite desnatado a 5% dissolvido em solução salina tamponada com Tris com Tween 20 a 0,1% ou TBST pelo período de incubação apropriado com balanço. Em seguida, lave a membrana três vezes com 20 mililitros de TBST fresco por 5 minutos por lavagem, seguido de incubação com 20 microlitros de soro receptor bruto em leite a 2,5% em TBST por 2 a 3 horas em temperatura ambiente.

No final da incubação, lave a membrana três vezes por 10 minutos por lavagem e incube as membranas com anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano humano de cabra por duas horas.

Remova o anticorpo secundário não ligado com três lavagens de 10 minutos em TBST e desenvolva as membranas em 5 mililitros de solução de luminol recém-preparada mais 5 mililitros de solução de peróxido. Após um minuto, visualize os sinais de quimioluminescência aprimorados em um gerador de imagens adequado.

Depois de salvar as imagens reveladas, incubar as membranas com 20 mililitros de tampão de decapagem comercial a 37 graus Celsius por 20 minutos, seguido de três lavagens de 10 minutos em TBST. Em seguida, bloqueie, reprove e visualize as membranas como acabamos de demonstrar com uma amostra de soro do mesmo paciente obtida em um momento diferente.