Detecção de histona Modificações nas folhas das plantas

O método a seguir oferece detecção confiável e sensível de modificações específicas da cromatina em genes de plantas selecionados. Primeiro reticulação de histonas modificadas e DNA com formaldeído. Em seguida, extraia e sonice a cromatina para facilitar a imunoprecipitação com anticorpos específicos de modificação.

Finalmente, analise a reação do chip pela ligação de escória de complexos de DNA de histonas e PCR quantitativo em tempo real específico do gene. Nas plantas, essa abordagem pode fornecer insights moleculares, como as modificações específicas de histonas associadas à fotossíntese de C quatro no labirinto e imunidade sistêmica em Arabidopsis. A principal vantagem da imunoprecipitação da cromatina sobre os métodos existentes, como a espectrometria de Marte, é que essas técnicas permitem a detecção de modificações de histon em sequências selecionadas no genoma da planta.

Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque o protocolo envolve algumas etapas cujo desempenho correto é a chave para o sucesso do procedimento. Neste vídeo, usamos a análise de chips para fornecer informações sobre a desregulação da expressão gênica na planta modelo Arabidopsis ANA, demonstrando que o procedimento será mic yakovich, um estudante de doutorado Para cada amostra, comece com uma colheita de dois gramas de folhas de arabidopsis e um tubo de plástico de 50 mililitros. Preencha a marca de 40 mililitros com tampão de reticulação e posicione uma esponja de filtro personalizada logo acima da superfície do tampão para garantir que as folhas permaneçam imersas.

Agora, coloque as amostras em um dessecador com vácuo e filtre por 10 minutos. Para interromper a reação de reticulação, adicione 2,5 mililitros de glicina de dois molares e misture por inversão. Em seguida, infiltre-se novamente por cinco minutos, continue a aspirar, infiltre-se por mais cinco minutos.

Em seguida, descarte o fluido enquanto colhe as folhas em uma peneira. Depois de lavar as folhas duas vezes com um litro de água em um copo de plástico, seque bem as folhas com papel toalha, colete as folhas em um tubo de plástico fresco e congele em nitrogênio líquido. Armazene as amostras a menos 80 graus Celsius até o isolamento da cromatina.

Usando um almofariz e pilão resfriados com nitrogênio líquido, triture as amostras congeladas até obter um pó fino. Transfira o pó para um tubo de plástico de 50 mililitros. Suspenda o pó em 30 mililitros de tampão de extração número um e incube por 15 minutos a quatro graus Celsius em um agitador suspenso.

Passe a suspensão por quatro camadas de pano de espelho em um tubo de plástico novo de 50 mililitros. Após a centrifugação, descarte o SUP natin. Em seguida, use um pincel para ressuspender o pellet em 50 microlitros do tampão de extração número dois e, em seguida, adicione mais 950 microlitros de tampão de extração.

Número dois, transfira a suspensão para um tubo de microfuga de 1,5 mililitro e centrifugue por 10 minutos. Enquanto isso, prepare dois tubos de micro fuge de mililitros contendo 1,5 mililitros de tampão de extração. Número três.

Em seguida, descarte os sobrenadantes para suspender gradualmente o pellet em 300 microlitros de tampão de extração. Número três. Primeiro, adicione um pequeno volume de buffer.

Número três, suspenda o pellet com um pincel e adicione o buffer restante. Agora coloque cuidadosamente as amostras em cima dos tubos preparados de 1,5 mililitros de tampão de extração. Número três, garantir que as duas fases não misturem amostras de centrífuga por uma hora a 16.000 vezes G a quatro graus Celsius.

Descarte o sup natin e suspenda o pellet de cromatina com um pincel em 300 microlitros de tampão de sonicação sonicar cromatina até um tamanho de DNA de aproximadamente 400 pares de bases. Quando sonicate, certifique-se de que a cromatina não seja aquecida acima de aproximadamente 30 graus Celsius. Para proteger as ligações cruzadas sensíveis ao calor, centrifugue a amostra de sonicado para precipitar o material não resolvido e colha o sobrenadante em dois tubos de micro fuge de mililitros contendo agarose proteica e tampão de ligação de anticorpos.

Adicione 200 microlitros da preparação de cromatina da amostra. Incube os tubos por uma hora em um agitador suspenso. Após centrifugação, colher os sobrenadantes da amostra e alíquota de 30 microlitros de proteína.

Tubos de 1,5 mililitro para determinação da concentração de cromatina do material de entrada. Reserve 40 microlitros da cromatina sonicada. Em seguida, adicione 400 microlitros da suspensão de cromatina sonicada aos 30 microlitros de proteína aros e uma quantidade apropriada de anticorpo específico de modificação incube durante a noite em um agitador suspenso a quatro graus Celsius.

Colha os grânulos por ificação por dois minutos a 440 vezes G.Remova o sobrenadante e execute lavagens sucessivas de 10 minutos de grânulos com 900 microlitros do respectivo tampão em um agitador suspenso. Após a lavagem final, remova completamente qualquer tampão restante. Para liberar o DNA das histonas, adicione 400 microlitros de tampão de reticulação D aos grânulos e a amostra de entrada de 40 microlitros preservada no vórtice anterior por cinco minutos, centrifugue amostras e incube a 65 graus Celsius durante a noite.

Agora, purifique o DNA com um kit comercial de purificação de DNA e execute o RTPC quantitativo em tempo real específico do locus convencional. Neste exemplo, a expressão do gene de defesa Arabidopsis ANA PR dois foi induzida por Benzo Diaz ole, um análogo sintético do hormônio vegetal ácido salicílico. Os resultados demonstram que a ativação da expressão de PR dois está associada a um aumento na acetilação de resíduos de lisina nas histonas H três e H quatro no promotor PR dois.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que a adição do tampão de extração um ao pó da folha causa sobrepressão no tubo fechado. Lembre-se de abrir o tubo de vez em quando. Além disso, lembre-se de não remover o pincel após a suspensão dos pellets antes da adição do próximo buffer.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como determinar suas modificações e alavancas simples onde formam reticulação baseada em aldeído de DNA e histonas, isolamento de imunoprecipitação de cromatina e quantificação de DNA específico do locus para responder a perguntas-chave sobre o papel da cromatina e suas modificações em diferentes campos da biologia vegetal.