Name: Detecção de histona Modificações nas folhas das plantas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Aprenda a detectar modificações de histonas em genes de plantas usando imunoprecipitação de cromatina e PCR quantitativo em tempo real. Este método revela mecanismos moleculares de regulação gênica em Arabidopsis.

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<p class="jove_content"> Este trabalho foi financiado pela Fundação Alemã de Ciência (DFG) ea Iniciativa de Excelência dos governos federal alemão e do Estado. </p>

<p class="jove_title"> 1. Reticulação de material vegetal </p><ol><li> Colheita 1-2g de folhas de Arabidopsis (6 a 10 centímetros de diâmetro de roseta) em um tubo plástico de 50 ml e encher-se para 40mL com tampão de reticulação. </li><li> Certifique-se de folhas de ficar imersa, por exemplo, encher um direito adaptado esponja do filtro acima da superfície buffer. Em seguida, coloque os tubos em um dessecador. </li><li> Vácuo infiltrado por 10min. A cada tubo adicionar 2,5 ml de glicina 2M para parar de reticulação, e inverter os tubos para justificar a dispersão igual de glicina. </li><li> Vácuo infiltrado por outro 5min e descarte de fluidos, enquanto o corte de folhas em uma peneira. </li><li> Lave as folhas duas vezes com 1L de água em um copo de vidro, em seguida, deixa secar bem com papel toalha. </li><li> Coleta de folhas em um tubo de plástico fresco e congelar em nitrogênio líquido. Loja deixa a -80 ° C até o isolamento da cromatina. </li></ol><p class="jove_title"> 2. Isolamento de cromatina </p><ol><li> Folhas foram moídas com argamassa e pistilo que foram mantidas em nitrogênio líquido até o uso. </li><li> Transferência de pó para um tubo plástico de 50 mL e suspendê-tampão de extração 30mL # 1. </li><li> Incubar por 15 min a 4 ° C em um agitador vertical. </li><li> Filtrado de suspensão por quatro camadas de miracloth em um tubo plástico de 50 mL fresco. </li><li> Rotação por 20min em 2800 xg, a 4 ° C. </li><li> Remover o sobrenadante e pellet suspender com um pincel em tampão de extração 1mL # 2. Primeiro adicionar um pequeno volume de tampão # 2, então suspender o pellet com um pincel, em seguida, adicione o restante do buffer. </li><li> Transferência de suspensão para um tubo de microcentrífuga 1,5 ml e girar para 10min a 12.000 xg, a 4 ° C. </li><li> Enquanto isso, prepare-microcentrífuga 2mL tubos contendo tampão de extração 1,5 ml # 3. </li><li> Remover o sobrenadante do tubo girou (passo 2.7) e suspender sedimento em 300 ul de tampão de extração n º 3. Primeiro adicionar um pequeno volume de tampão # 3, suspender pellet com um pincel, e depois adicionar o buffer restante. </li><li> Pipeta com cuidado o pellet suspenso (passo 2.9) em cima do tampão de extração 1,5 mL # 3 preparada no passo 2.8. Certifique-se que as duas fases não se misturam. Rotação por 1h a 16.000 xg, a 4 ° C. </li><li> Remover o sobrenadante e pellet suspender cromatina com um pincel em 300 ul de tampão de sonicação. </li><li> Sonicate cromatina com um sonotrodo, ou em um banho ultra-sônico, para um tamanho de DNA de aproximadamente 400pb. Quando sonicando, fazer cromatina certeza não vai ser aquecido acima de aproximadamente 30 ° C para proteger sensíveis ao calor ligações cruzadas. A duração da sonicação precisa ser determinado experimentalmente, porque varia significativamente entre os dispositivos sonicação diferentes. Para orientação, as definições para dois dispositivos diferentes são fornecidos: </li></ol><p class="jove_content"> Para sonicação com uma marca Bandelin sonotrodo expor cromatina em tubo de microcentrífuga de 0,6 ml cinco vezes a 20 explosões com configurações de 25% de energia de ciclo, = 50. Ao fazê-lo amostra, fresco após cada 20 rajadas <sup>º</sup> em banho de gelo. </p><p class="jove_content"> Para sonicação com um banho de ultra-som Bioruptor Diagenode, preencha banho com água e gelo e sonicate dez vezes por 30 segundos em tubos de microcentrífuga 1,5 ml com ajuste de 'alto'. Depois a cada 30 segundos, as amostras de fresco por mais 30 segundos. </p><ol start="13"><li> Spin-sonicado amostra para 5min a 16.000 g a 4 ° C para precipitar o material não dissolvido. O sobrenadante pode ser usado diretamente para imunoprecipitação. Alternativamente, as amostras podem ser de choque congelado em nitrogênio líquido e armazenadas a -80 ° C até à sua utilização. </li></ol><p class="jove_title"> 3. Imunoprecipitação </p><ol><li> Prepare os tubos de 2 mL de microcentrífuga contendo proteína-A 40μL. Agarose e 1.8mL de anticorpos de ligação de tampão Adicionar 200μL da preparação da cromatina (passo 2.13). </li><li> Incubar os tubos por 1h em um agitador vertical. </li><li> Descarte de proteína-A agarose contas e usar o sobrenadante para imunoprecipitação. </li><li> Remover uma alíquota de 40μL para determinar a concentração de cromatina ('input'). </li><li> Adicionar 30μL de proteína-A. Agarose ea quantidade de anticorpos específicos de modificação que está indicado na tabela abaixo de reagentes e equipamentos específicos para suspensão da cromatina 400μL sonicado </li><li> Incubar por 2.5h ou durante a noite em um agitador vertical a 4 ° C. </li><li> Spin down contas de 2min em 440 x g. </li><li> Lavar talão pellet com 900μL de cada tampão de lavagem (veja a lista abaixo). Para cada buffer, contas incubar no buffer de 10min em um agitador vertical a 4 ° C, em seguida, girar para a 2min a 440 xg, elimine o sobrenadante e adicionar o próximo buffer. <ol><li> Tampão de lavagem pouco sal </li><li> Tampão de lavagem de alta sal </li><li> LiCl tampão de lavagem </li><li> TE tampão de lavagem </li></ol></li><li> Após a última lavagem, remover completamente qualquer solução remanescente. </li></ol><p class="jove_title"> 4. De crosslinking de histonas e DNA, e purificação de DNA precipitado </p><ol><li> Adicionar 100μL de reticulação de-buffer para o pellet agarose e amostra 'input' do 40μl a partir do passo 3.4, mix de 5min em um misturador vórtice, as amostras de spin, e incubate a 65 ° C durante a noite. </li><li> Purificar DNA com DNA comercial ou kit de purificação de PCR. </li><li> Tipicamente 5μl de uma diluição de 1:05 do eluído finais são suficientes para executar convencionais lugar específico quantitativa em tempo real de RT-PCR (RT-qPCR). </li></ol><p class="jove_title"> 5. Tabela de buffers </p><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>Buffer de reticulação</strong> </td></tr><tr><td> Butirato de sódio </td><td> 10mM </td></tr><tr><td> Sacarose </td><td> 400mm </td></tr><tr><td> Tris-HCl, pH 8,0 </td><td> 10mM </td></tr><tr><td> β-mercaptoetanol </td><td> 5mM </td></tr><tr><td> Formaldeído </td><td> 3% (v / v) </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>Tampão de extração # 1</strong> </td></tr><tr><td> Butirato de sódio </td><td> 10mM </td></tr><tr><td> Sacarose </td><td> 400mm </td></tr><tr><td> Tris-HCl, pH 8,0 </td><td> 10mM </td></tr><tr><td> β-mercaptoetanol </td><td> 5mM </td></tr><tr><td> Inibidor de Protease completo </td><td> 1x </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>Tampão de extração # 2</strong> </td></tr><tr><td> Butirato de sódio </td><td> 10mM </td></tr><tr><td> Sacarose </td><td> 250mm </td></tr><tr><td> Tris-HCl, pH 8,0 </td><td> 10mM </td></tr><tr><td> β-mercaptoetanol </td><td> 5mM </td></tr><tr><td> MgCl <sub>2</sub> </td><td> 10mM </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> 1% (w / v) </td></tr><tr><td> Inibidor de Protease completo </td><td> 1x </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>Tampão de extração # 3</strong> </td></tr><tr><td> Butirato de sódio </td><td> 10mM </td></tr><tr><td> Sacarose </td><td> 1.7M </td></tr><tr><td> Tris-HCl, pH 8,0 </td><td> 10mM </td></tr><tr><td> β-mercaptoetanol </td><td> 5mM </td></tr><tr><td> MgCl <sub>2</sub> </td><td> 2mM </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> 0,15% (w / v) </td></tr><tr><td> Inibidor de Protease completo </td><td> 1x </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>Tampão de sonicação</strong> </td></tr><tr><td> Tris-HCl, pH 8,0 </td><td> 25mM </td></tr><tr><td> EDTA-NaOH, pH 8,0 </td><td> 5mM </td></tr><tr><td> SDS </td><td> 0,5% (w / v) </td></tr><tr><td> Inibidor de Protease completo </td><td> 1x </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>Tampão de ligação do anticorpo</strong> </td></tr><tr><td> Tris-HCl, pH 8,0 </td><td> 50mM </td></tr><tr><td> EDTA-NaOH, pH 8,0 </td><td> 1mM </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 150mm </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> 0,1% (w / v) </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>Tampão de lavagem pouco sal</strong> </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 150mm </td></tr><tr><td> SDS </td><td> 0,1% (w / v) </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> 1% (w / v) </td></tr><tr><td> EDTA-NaOH, pH 8,0 </td><td> 2mM </td></tr><tr><td> Tris-HCl, pH 8,0 </td><td> 20mM </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>Tampão de lavagem de alta sal</strong> </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 500mM </td></tr><tr><td> SDS </td><td> 0,1% (w / v) </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> 1% (w / v) </td></tr><tr><td> EDTA-NaOH, pH 8,0 </td><td> 2mM </td></tr><tr><td> Tris-HCl, pH 8,0 </td><td> 20mM </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>LiCl tampão de lavagem</strong> </td></tr><tr><td> Cloreto de lítio </td><td> 250mm </td></tr><tr><td> Nonidet-P40 </td><td> 1% (v / v) </td></tr><tr><td> Desoxicolato de sódio </td><td> 1% (w / v) </td></tr><tr><td> EDTA-NaOH, pH 8,0 </td><td> 1mM </td></tr><tr><td> Tris-HCl, pH 8,0 </td><td> 20mM </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> <strong>TE tampão de lavagem</strong> </td></tr><tr><td> EDTA-NaOH, pH 8,0 </td><td> 10mM </td></tr><tr><td> Tris-HCl, pH 8,0 </td><td> 1mM </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> <strong>Tampão Decrosslinking</strong> </td></tr><tr><td> Tris-HCl, pH 6,8 </td><td> 62,5 mm </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 200mM </td></tr><tr><td> SDS </td><td> 2% (w / v) </td></tr><tr><td> TDT </td><td> 10mM </td></tr></tbody></table><p class="jove_title"> 6. Resultados representativos: </p><p class="jove_content"> Expressão do gene <em>Arabidopsis thaliana</em> defesa <em>PR2</em> codifica uma β-1,3-glucanase com atividade antimicrobiana <sup>12,</sup> foi induzido por benzothiadiazole (BTH), um análogo sintético do ácido salicílico hormônio vegetal <sup>3.</sup> <strong>Figura 1</strong> demonstra que a ativação de <em>PR2</em> expressão é associada a um aumento na acetilação de resíduos de lisina na histona H3 e H4 do promotor <em>PR2.</em> Como a densidade diminui nucleosome durante a ativação do gene <sup>13,</sup> os valores de acetilação das histonas foram normalizados para o sinal obtido com um anticorpo para uma região invariante de 3 histonas. </p><p class="jove_content"><img src="/files/ftp_upload/3096/3096fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"><br> <strong>Figura 1 BTH induz acetilação das histonas no promotor <em>PR2</em> em Arabidopsis.</strong> As plantas foram tratadas com 100μM BTH ou um controle de pó molhável. Após 72h, foram coletadas folhas e cromatina foi isolado. O sinal obtido após precipitação com acetilação anticorpos específicos (como indicado na figura) foi normalizada para o sinal obtido por precipitação com um anticorpo para um domínio invariante de histona H3. Cromatina precipitado foi quantificada por RT-qPCR. Dados são padronizados para níveis de modificação das histonas na ausência de tratamento BTH. </p>

<ol><li>Eberharter, A., Becker, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+acetylation%3A+a+switch+between+repressive+and+permissive+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+rep%22%5BJournal%5D)">Histone acetylation: a switch between repressive and permissive chromatin.</a> <em>EMBO rep</em>. <strong>3</strong>, 224-229 (2002).</li>
<li>Ruthenburg, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylation+of+lysine+4+on+histone+H3%3A+intricacy+of+writing+and+reading+a+single+epigenetic%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Methylation of lysine 4 on histone H3: intricacy of writing and reading a single epigenetic.</a> <strong>25</strong>, 15-30 (2007).</li>
<li>Jaskiewicz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modification+acts+as+a+memory+for+systemic+acquired+resistance+in+the+plant+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+rep%22%5BJournal%5D)">Chromatin modification acts as a memory for systemic acquired resistance in the plant stress response.</a> <em>EMBO rep</em>. <strong>12</strong>, 50-55 (2011).</li>
<li>Ng, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ordered+histone+modifications+are+associated+with+transcriptional+poising+and+activation+of+the+phaseolin+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Ordered histone modifications are associated with transcriptional poising and activation of the phaseolin promoter.</a> <em>Plant Cell</em>. <strong>18</strong>, 119-132 (2006).</li>
<li>Offermann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illumination+is+necessary+and+sufficient+to+induce+histone+acetylation+independent+of+transcriptional+activity+at+the+C4-specific+phosphoenolpyruvate+carboxylase+promoter+in+maize%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Illumination is necessary and sufficient to induce histone acetylation independent of transcriptional activity at the C4-specific phosphoenolpyruvate carboxylase promoter in maize.</a> <em>Plant Physiol</em>. <strong>141</strong>, 1078-1088 (2006).</li>
<li>Deng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+the+histone+acetyltransferase+AtHAC1+in+the+regulation+of+flowering+time+via+repression+of+FLOWERING+LOCUS+C+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Involvement of the histone acetyltransferase AtHAC1 in the regulation of flowering time via repression of FLOWERING LOCUS C in Arabidopsis.</a> <em>Plant Physiol</em>. <strong>143</strong>, 1660-1668 (2007).</li>
<li>Benhamed, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+GCN5%2C+HD1%2C+and+TAF1%2FHAF2+interact+to+regulate+histone+acetylation+required+for+light-responsive+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis GCN5, HD1, and TAF1/HAF2 interact to regulate histone acetylation required for light-responsive gene expression.</a> <em>Plant Cell</em>. <strong>18</strong>, 2893-2903 (2006).</li>
<li>Bowler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+techniques+for+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Chromatin techniques for plant cells.</a> <em>Plant Journal</em>. <strong>39</strong>, 776-789 (2004).</li>
<li>Orlando, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+chromosomal+proteins+in+vivo+by+formaldehyde+decrosslinked-chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">Mapping chromosomal proteins in vivo by formaldehyde decrosslinked-chromatin immunoprecipitation.</a> <em>Trends Biochem. Sci</em>. <strong>25</strong>, 99-104 (2000).</li>
<li>Haring, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation%3A+optimization%2C+quantitative+analysis+and+data+normalization%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Meth%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization.</a> <em>Plant Meth</em>. <strong>3</strong>, 11-11 (2007).</li>
<li>Danker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+information+but+not+promoter+activity+controls+the+methylation+state+of+histone+H3+lysine+4+on+two+photosynthetic+genes+in+maize%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Developmental information but not promoter activity controls the methylation state of histone H3 lysine 4 on two photosynthetic genes in maize.</a> <em>Plant J</em>. <strong>53</strong>, 465-474 (2008).</li>
<li>Uknes, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquired+resistance+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Acquired resistance in Arabidopsis.</a> <em>Plant Cell</em>. <strong>4</strong>, 645-656 (1992).</li>
<li>Workman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleosome+displacement+in+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Develop%22%5BJournal%5D)">Nucleosome displacement in transcription.</a> <em>Genes Develop</em>. <strong>20</strong>, 2009-2017 (2006).</li>
</ol>

<p class="jove_content"> Não há conflitos de interesse declarados. </p>

<p class="jove_content"> Etapas mais críticas no protocolo são a reticulação de DNA e histonas, o tipo ea quantidade de material foliar, moagem do material, ea sonicação de cromatina. Para uma discussão mais detalhada dessas questões, ver refs. 9 e 10. </p><p class="jove_step"> Sonicação e crosslinking: </p><p class="jove_content"> É importante para interromper cromatina durante a sonicação a fragmentos de cerca de 400pb. Sonicação exaustiva irá destruir cromatina interrompendo DNA e histonas, enquanto que sonicação insuficiente vai deixar fragmentos de cromatina longo. Estes afetam a especificidade do método, porque modificações das histonas distal do locus testados não podem ser discriminados de alterações local. Eficiência sonicação é melhor testado através da recolha de cromatina 20μL de amostras de DNA antes e depois sonicação, de reticulação e histonas, isolando o DNA e determinar o comprimento do DNA cortado por eletroforese em gel de agarose. RNAse deve ser adicionado às amostras antes de eletroforese, porque a preparação da cromatina ainda contém grandes quantidades de RNA nesta fase de purificação que pode interferir com a visualização de DNA fragmentado. As amostras são úteis para imunoprecipitação da cromatina se o DNA de cromatina não-cortado é maior do que 10kbp, enquanto que o DNA de cromatina sheared forma uma mancha com intensidade máxima do sinal em torno de 400pb de DNA. </p><p class="jove_content"> Rotineiramente usamos 3% (v / v) de formaldeído para crosslinking cromatina em folhas intactas, mas 1% (v / v) de formaldeído pode ser suficiente na maioria dos casos. Em nossas mãos, as concentrações de formaldeído baixo permitem menor tempo de sonicação e sinais de fundo em reações consequente PCR. No entanto, quantidades insuficientes de formaldeído muitas vezes resultam em baixa reprodutibilidade do sinal de PCR entre os experimentos independentes. Isso pode ser devido a penetração insuficiente de folhas com formaldeído em baixas concentrações. Certifique-se de trocar o seu estoque de formaldeído com freqüência como o composto tende a polimerizar com o tempo. As soluções de formaldeído são estáveis ​​apenas para cerca de um mês, e este período é prolongado por quase estabilização metanol. É aconselhável a análise de diferentes concentrações de formaldeído durante a configuração de condições experimentais. </p><p class="jove_step"> Quantidade de material vegetal e de moagem: </p><p class="jove_content"> É importante para se infiltrar pequenas quantidades de material foliar em um grande volume de tampão para evitar que as folhas grudem umas nas outras. Folha furando muitas vezes resulta em infiltração insuficiente de formaldeído. Além disso, o material vegetal muito vai bloquear os poros do tecido miracloth. A eficiência de moagem depende consideravelmente usando um almofariz e um pilão, com o ajuste perfeito. Rotineiramente moer com nitrogênio líquido refrigerado pilão na ausência de nitrogênio líquido adicional de três vezes por 50 segundos até que o material é moído para um pó fino. </p>

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários </th></tr><tr><td> Proteína-A-Agarose </td><td> Roche </td><td> 11 134 515 001 </td><td> depende da classe de anticorpos </td></tr><tr><td> Proteína-G-Agarose </td><td> Roche </td><td> 11 243 233 001 </td><td> depende da classe de anticorpos </td></tr><tr><td> Anti-hyperacetyl-H4 </td><td> Millipore </td><td> 06-946 </td><td> usamos 5μL </td></tr><tr><td> Anti-acetil-H4K5 </td><td> Millipore </td><td> 07-327 </td><td> usamos 5μL </td></tr><tr><td> Anti-acetil-H4K8 </td><td> Millipore </td><td> 07-328 </td><td> usamos 5μL </td></tr><tr><td> Anti-acetil-H4K12 </td><td> Millipore </td><td> 07-595 </td><td> usamos 5μL </td></tr><tr><td> Anti-acetil-H4K16 </td><td> Millipore </td><td> 07-329 </td><td> usamos 5μL </td></tr><tr><td> Anti-acetil-H4K18 </td><td> Millipore </td><td> 07-354 </td><td> usamos 1μL </td></tr><tr><td> Anti-acetil-H3K9 </td><td> Millipore </td><td> 07-352 </td><td> usamos 5μL </td></tr><tr><td> Anti-acetil-H3K14 </td><td> Millipore </td><td> 07-353 </td><td> usamos 1μL </td></tr><tr><td> Anti-trimetil-H3K4 </td><td> Diagenode </td><td> PAB-003-50 </td><td> usamos 5μL </td></tr><tr><td> Anti-dimetil-H3K4 </td><td> Millipore </td><td> 07-030 </td><td> usamos 5μL </td></tr><tr><td> Anti-monometil-H3K4 </td><td> Abcam </td><td> ab8895 </td><td> 2,5-10μL </td></tr><tr><td> Anti-H3 </td><td> Abcam </td><td> ab1791 </td><td> usamos 1μL para verificar a densidade das histonas </td></tr><tr><td> Bioruptor </td><td> Diagenode </td><td> UCD TO-200 </td><td></td></tr><tr><td> Sonotrodo MS72 </td><td> Bandelin </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Miracloth </td><td> Calbiochem </td><td> 475855 </td><td></td></tr><tr><td> Inibidor de Protease completo </td><td> Roche </td><td> 11836145001 </td><td></td></tr></tbody></table>

detecção de histona modificações nas folhas das plantas

Detection of Histone Modifications in Plant Leaves

<p class="jove_content"> Estrutura da cromatina é importante para a regulação da expressão gênica em eucariotos. Neste processo, a remodelação da cromatina, a metilação do DNA e modificações covalentes nas caudas amino-terminal de histonas H3 e H4 desempenham papéis essenciais <sup>1-2.</sup> H3 e H4 modificações das histonas incluem metilação de lisina e arginina, acetilação da lisina e fosforilação de resíduos de serina <sup>1-2.</sup> Essas modificações estão associadas tanto com a ativação do gene, a repressão, ou um estado preparado de gene que suporta a ativação mais rápida e robusta de expressão após a percepção de sinais apropriados (micróbio-padrões moleculares associados, luz, hormônios, etc) <sup>3-7.</sup> </p><p class="jove_content"> Aqui, apresentamos um método para a detecção confiável e sensível de modificações específicas da cromatina em genes de plantas selecionadas. A técnica é baseada na reticulação de (modificado) histonas e DNA com formaldeído <sup>8,9,</sup> extração e sonicação da cromatina, cromatina imunoprecipitação (CHIP) com a modificação de anticorpos específicos <sup>9,10,</sup> de reticulação de histona-DNA complexos, e gene-específicos em tempo real, PCR quantitativo. A abordagem tem se mostrado útil para detectar modificações específicas histonas associadas C <sub>4</sub> fotossíntese em <sup>5,11</sup> milho e imunidade sistêmica em <sup>3</sup> Arabidopsis. </p>

<p class="jove_content">Uma abordagem confiável e útil para detectar modificações das histonas em genes específicos de plantas é descrito. A abordagem combina cromatina imunoprecipitação (chip) e real-time PCR quantitativo. Ela permite a detecção de modificações das histonas em genes específicos, com um papel em diversos processos fisiológicos.</p>

Detecção de histona Modificações nas folhas das plantas

A estrutura da cromatina é importante para a regulação da expressão gênica em eucariotos. Nesse processo, a remodelação da cromatina, a metilação do DNA e a covalente...

<p>O método a seguir oferece detecção confiável e sensível de modificações cromatínicas específicas em genes vegetais selecionados. Primeiro, realize a reticulação cruzada entre histonas modificadas e DNA com formaldeído. Em seguida, extraia e sonique o cromatina para facilitar a imunoprecipitação com anticorpos específicos para a modificação.</p><p>Finalmente, analise a reação do chip por meio da ligação de complexos de histona-DNA e PCR quantitativa em tempo real específica para o gene. Em plantas, essa abordagem pode fornecer informações moleculares, como as modificações específicas de histonas associadas à fotossíntese C4 no milho e à imunidade sistêmica em Arabidopsis. A principal vantagem da imunoprecipitação de cromatina em comparação com métodos existentes, como a espectrometria de Mars, é que esta técnica permite a detecção de modificações de histonas em sequências selecionadas do genoma vegetal.</p><p>De modo geral, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades, pois o protocolo envolve algumas etapas cuja execução correta é fundamental para o sucesso do procedimento. Neste vídeo, utilizamos a análise em chip para investigar a desregulação da expressão gênica na planta modelo Arabidopsis ANA, demonstrando o procedimento com Mic Yakovich, estudante de doutorado. Para cada amostra, comece com a coleta de dois gramas de folhas de Arabidopsis e um tubo plástico de 50 mililitros. Complete até a marca de 40 mililitros com tampão de reticulação e posicione uma esponja filtro personalizada logo acima da superfície do tampão para garantir que as folhas permaneçam imersas.</p><p>Agora, coloque as amostras em um dessecador com vácuo e filtre por 10 minutos. Para interromper a reação de reticulação, adicione 2,5 mililitros de glicina 2 molares e misture por inversão. Em seguida, infiltre novamente por cinco minutos, mantenha o vácuo e infiltre por mais cinco minutos.</p><p>Em seguida, descarte o fluido enquanto coleta as folhas em uma peneira. Após lavar as folhas duas vezes com um litro de água em um béquer de plástico, seque bem as folhas com papel-toalha, reúna-as em um tubo plástico novo e congele em nitrogênio líquido. Armazene as amostras a menos 80 graus Celsius até o isolamento da cromatina.</p><p>Usando um almofariz e pistilo resfriados com nitrogênio líquido, triture as amostras congeladas até obter um pó fino. Transfira o pó para um tubo plástico de 50 mililitros. Suspenda o pó em 30 mililitros do tampão de extração número um e incube por 15 minutos a quatro graus celsius em um agitador orbital.</p><p>Passe a suspensão por quatro camadas de pano espelho para um tubo plástico novo de 50 mililitros. Após a centrifugação, descarte o SUP natin. Em seguida, use um pincel para ressuspender o pellet em 50 microlitros do tampão de extração número dois e, então, adicione mais 950 microlitros do tampão de extração.</p><p>Número dois, transfira a suspensão para um tubo microfuga de 1,5 mililitro e centrifugue por 10 minutos. Enquanto isso, prepare tubos microfuga de 2 mililitros contendo 1,5 mililitro de tampão de extração. Número três.</p><p>Em seguida, descarte os sobrenadantes para suspender gradualmente o precipitado em 300 microlitros de tampão de extração. Número três. Primeiro, adicione um pequeno volume de tampão.</p><p>Passo três, suspenda o pellet com um pincel e então adicione o restante do tampão. Agora, sobreponha cuidadosamente as amostras sobre os tubos preparados contendo 1,5 mililitros de tampão de extração. Passo três, assegurando que as duas fases não se misturem, centrifugue as amostras por uma hora a 16.000 × g a quatro graus Celsius.</p><p>Descarte o sobrenadante e suspenda o pellet de cromatina com um pincel em 300 microlitros de tampão de sonicação. Sonique a cromatina até obter um tamanho de DNA de aproximadamente 400 pares de bases. Durante a sonicação, certifique-se de que a cromatina não aqueça acima de aproximadamente 30 graus Celsius. Para proteger as ligações cruzadas sensíveis ao calor, centrifugue a amostra sonificada para precipitar o material não solubilizado e colete o sobrenadante em tubos microfuga de dois mililitros contendo agarose proteica e tampão de ligação de anticorpo.</p><p>Adicione 200 microlitros da preparação de cromatina da amostra. Incube os tubos por uma hora em um agitador rotativo. Após a centrifugação, colete os sobrenadantes das amostras e alíquotas de 30 microlitros de proteína.</p><p>Adicione 1,5 tubo de 1,5 mililitro fresco para determinação da concentração de cromatina do material de entrada. Reserve 40 microlitros da cromatina sonificada. Em seguida, adicione 400 microlitros da suspensão de cromatina sonificada aos 30 microlitros de proteína A/G e à quantidade apropriada de anticorpo específico para modificação e incube durante a noite em agitador orbital a quatro graus Celsius.</p><p>Colete as esferas por centrifugação durante dois minutos a 440 ×g. Remova o sobrenadante e realize sucessivas lavagens dos pelotões de esferas por 10 minutos com 900 µL do respectivo tampão em um agitador orbital. Após a lavagem final, remova completamente qualquer tampão remanescente. Para liberar o DNA dos histones, adicione 400 µL de tampão de descrosslinking às esferas e à amostra de entrada de 40 µL preservada anteriormente, vorteixe por cinco minutos, centrifugue as amostras e incube a 65 °C durante a noite.</p><p>Agora, purifique o DNA utilizando um kit comercial de purificação de DNA e realize a reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real convencional específica para o locus. Neste exemplo, a expressão do gene de defesa ANA PR dois de Arabidopsis foi induzida pelo benzo diazol, um análogo sintético do hormônio vegetal ácido salicílico. Os resultados demonstram que a ativação da expressão de PR dois está associada a um aumento na acetilação dos resíduos de lisina nas histonas H três e H quatro no promotor de PR dois.</p><p>Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que a adição do tampão de extração um ao pó foliar causa pressão excessiva no tubo fcon fechado. Lembre-se de abrir o tubo periodicamente. Além disso, lembre-se de não remover a escova de pintura após a suspensão dos pelotes antes da adição do próximo tampão.</p><p>Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como determinar modificações de histonas e níveis gênicos utilizando a fixação com base em aldeído do DNA e histonas, isolamento de cromatina por imunoprecipitação e quantificação específica de DNA por locus para responder questões-chave sobre o papel da cromatina e suas modificações em diferentes áreas da biologia vegetal.</p>

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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