Uma técnica para cultivar neurônios do hipocampo de camundongos

Pegue um hipocampo de filhote de rato colhido em um buffer.

Corte o hipocampo em fragmentos menores e transfira-os para um tubo cônico.

Lave o lenço com tampão. Depois que os fragmentos se acomodarem, remova o buffer. Agora, adicione tampão fresco e tripsina.

Durante a incubação, a tripsina, uma enzima proteolítica, digere a matriz extracelular do tecido, soltando os neurônios do hipocampo.

Lave o tecido digerido com tampão.

Depois que os fragmentos se acomodarem, remova o buffer. Adicione tampão fresco e pipete o tecido repetidamente para dissociá-lo mecanicamente, obtendo uma suspensão unicelular.

Assim que o tecido não digerido assentar, transfira a suspensão celular para lamínulas revestidas de poli-L-lisina com suportes de cera dentro de uma placa de cultura contendo meio.

As células se ligam às superfícies revestidas de poli-L-lisina por meio de interações eletrostáticas.

Agora, coloque as lamínulas aderidas aos neurônios voltadas para baixo em um prato contendo células gliais corticais ou não neuronais em meio sem soro.

Na cultura, os suportes de cera evitam o contato direto entre neurônios e células gliais, criando um microambiente onde os fatores secretados pelas células gliais promovem a sobrevivência e a maturação neuronal.

Para começar, disseque de seis a oito hipocampos de filhotes pós-natais de um dia de idade com meio HBSS em uma placa de Petri. Pique o hipocampo com uma tesoura de dissecção em pedaços menores e transfira-os do prato para um tubo de 15 mililitros. Lave o hipocampo duas vezes com 5 mililitros de HBSS e deixe-os em 4,5 mililitros de HBSS após a lavagem.

Adicione 0,5 mililitros de tripsina a 2,5% em 4,5 mililitros de HBSS e incube em banho-maria a 37 graus Celsius por 15 minutos, invertendo o tubo a cada 5 minutos. Hipocampos bem digeridos devem se tornar pegajosos e formar um aglomerado. Se necessário, prolongue a digestão por mais 5 minutos.

Lave o hipocampo com HBSS três vezes por 5 minutos por lavagem. Após a lavagem, adicione 2 mililitros de HBSS e pipete o hipocampo para cima e para baixo com uma pipeta Pasteur 15 vezes. Triturar o tecido com uma pipeta Pasteur polida a fogo 10 vezes e descansar o tubo por cinco minutos até que todos os pedaços endureçam no fundo. Repita a trituração com os pedaços restantes até que a maioria deles tenha desaparecido.

Em seguida, use uma ponta de pipeta de 1 mililitro para transferir suavemente o sobrenadante contendo os neurônios dissociados para placas de revestimento. Adicione-o diretamente ao meio de revestimento pré-incubado e agite a placa suavemente. 2 a 4 horas após a semeadura, verifique as placas de revestimento com um microscópio óptico. A maioria dos neurônios deve ter se ligado à lamínula.

Usando uma pinça de ponta fina, vire as lamínulas para as placas alimentadoras de células gliais contendo meio de cultura neuronal pré-condicionado com o lado do ponto de cera voltado para baixo. Os neurônios podem crescer nos pratos alimentadores de células da glia por até um mês. Alimente os neurônios a cada sete dias com 1 mililitro de meio de cultura neuronal fresco.