Gerando uma cultura de neurônios primários de baixa densidade a partir de neurônios embrionários congelados

Comece com um criovial contendo neurônios embrionários criopreservados e coloque-o em um bloco de aquecimento para descongelamento controlado.

Em seguida, transfira os neurônios descongelados para um tubo e dilua-os com um meio neurobasal gota a gota para equilibrar a pressão osmótica e evitar a lise celular.

Isso gera uma suspensão homogênea com neurônios uniformemente dispersos.

Semeie a suspensão neural diluída em uma placa de vários poços revestida com poli-L-lisina contendo um meio neurobasal enriquecido com nutrientes e antibióticos.

Incubar para permitir que a poli-L-lisina carregada positivamente interaja com os neurônios por meio de interações eletrostáticas, facilitando sua adesão.

Abasteça os poços com meios neurobasais frescos.

Incube as células no mesmo meio sob condições úmidas para evitar a evaporação do meio.

Os neurônios embrionários utilizam os nutrientes e crescem desenvolvendo processos neuronais e formando neurônios primários.

O meio neurobasal mantém os neurônios primários que parecem amplamente espaçados, gerando uma cultura primária de baixa densidade com conexões neuronais.

Comece revestindo uma microplaca de 96 poços com 100 microlitros de poli-L-lisina por poço. Em seguida, incube as placas durante a noite a 37 graus Celsius. No final da incubação, remova a solução de poli-L-lisina. Lave as placas duas vezes com água esterilizada e uma vez com meio de cultura fresco sem suplemento. Coloque os pratos para secar. As placas secas podem ser embaladas e armazenadas por até um mês a 4 graus Celsius.

Para iniciar a semeadura celular, adicione 50 microlitros do meio de cultura a cada poço na placa revestida. Encha os poços periféricos com 200 microlitros de água esterilizada e incube a placa por uma hora a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.

Remova o neurônio criovial do tanque de nitrogênio líquido e coloque-o em um bloco de calor de 37 graus Celsius para descongelar parcialmente seu conteúdo. Usando uma pipeta de 1 mililitro com ponta larga, transfira lentamente o conteúdo do frasco gota a gota para um tubo estéril de 50 mililitros. Lave o criovial vazio com 1 mililitro de meio de cultura em temperatura ambiente. Transfira a solução de enxágue para o tubo de 50 mililitros contendo a suspensão celular.

Em seguida, adicione 9 mililitros do meio de cultura em temperatura ambiente gota a gota no tubo de 50 mililitros, perfazendo o volume para 11 mililitros. Depois de contar as células usando um hemocitômetro, transfira a suspensão celular para um reservatório. Agora, usando uma pipeta multicanal com pontas de furo largo, dispense a suspensão de células com uma contagem final de 1,0 x 10⁴ células por poço na placa revestida de 96 poços.

Incube os neurônios por 1 a 2 horas a 37 graus Celsius sob 5% de dióxido de carbono. Em seguida, substitua o meio de cultura por 100 microlitros de meio de cultura pré-aquecido e incube novamente nas mesmas condições.