Geração e Diferenciação de Neuroesferas Primárias a partir de Células-Tronco Neurais de Peixe-Zebra

Comece com uma placa multipoços contendo um meio de crescimento enriquecido com fatores de crescimento.

Semeie uma suspensão unicelular de células-tronco neurais do peixe-zebra e incuba.

Inicialmente, as células-tronco utilizam os fatores de crescimento e proliferam.

Remova os detritos e adicione o meio fresco para promover a proliferação celular contínua e a agregação espontânea para formar neuroesferas primárias flutuantes.

Em seguida, transfira as neuroesferas para um poço fresco contendo o meio de crescimento.

Incubar nas mesmas condições para induzir uma expansão progressiva das neuroesferas.

Pipete repetidamente para dissociar mecanicamente as neuroesferas em pequenos grupos.

Em seguida, transfira-os para uma matriz extracelular bem revestida, facilitando sua adesão.

Substituir o meio de crescimento por um meio de diferenciação sem factor de crescimento que contenha insulina.

A ausência de fatores de crescimento e a presença de insulina estimulam a diferenciação celular em células gliais e neurônios com projeções neuronais.

Para se preparar para a geração de neuroesferas, encha cada poço de uma placa de 24 poços com 300 microlitros de meio fresco de condição Z. Em seguida, adicione 200 microlitros da suspensão celular a cada poço, semeando-os a uma densidade de aproximadamente 500 células por microlitro. Em seguida, incube a placa a 30 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono.

Após um dia de cultura, veja as células na placa de 24 poços ao microscópio. Espere observar suspensões de célula única nesta fase. Se algum detrito for coletado no centro de um poço, remova-o pipetando aproximadamente 100 microlitros de meio e substitua esse líquido adicionando 100 microlitros de meio fresco em condição Z. Depois que todos os detritos forem removidos, incube a placa nas condições descritas anteriormente.

Após um dia adicional de cultura, transfira 250 microlitros de suspensão celular de um único poço para um novo poço vazio. Repita esta etapa para todos os 24 poços. Em seguida, adicione 250 microlitros de meio fresco de condição Z a cada poço e homogeneize as suspensões pipetando suavemente para cima e para baixo. Incubar novamente as placas nas mesmas condições e repetir este processo de expansão após um dia adicional de cultura. Espere observar um aumento progressivo no tamanho das neuroesferas no terceiro e quarto dias desse período.

Para começar a passar, após quatro dias, remova 250 microlitros de meio, mas sem neuroesferas, de cada poço. Em seguida, use uma pipeta de 1 mililitro para dissociar mecanicamente as neuroesferas no volume médio restante. Prossiga para agrupar a suspensão celular de cada poço dissociado. Em seguida, conte as células com um hemocitômetro e distribua 250 microlitros de sobrenadante de cultura primária contendo 800 células por microlitro em cada poço de uma nova placa de 24 poços. Continue adicionando 250 microlitros de meio em condição Z a cada poço e, em seguida, incubando a placa conforme descrito anteriormente.