Um método in vitro para gerar organoides cerebrais humanos

Comece com uma cultura de neuroesferas, aglomerados flutuantes de células progenitoras neuroepiteliais.

Transfira essas neuroesferas para uma folha de incorporação.

Remova a mídia. Adicione uma gota de matriz de membrana extracelular contendo proteínas e fatores de crescimento a cada neuroesfera.

Incubar para que a matriz se solidifique, incorporando as neuroesferas dentro dela.

Agora, transfira as neuroesferas incorporadas à matriz usando meios de neuroesferas para uma placa de cultura contendo meios de neuroesferas.

incubar. A matriz da membrana extracelular e seus constituintes facilitam a diferenciação das células progenitoras neuroepiteliais em células neuroepiteliais que proliferam e formam lúmens cheios de líquido.

Após a incubação, transfira as neuroesferas para um frasco giratório contendo meios organoides cerebrais pré-aquecidos. Incube com agitação para aumentar a difusão de oxigênio e nutrientes, promovendo o crescimento celular.

Fatores de crescimento e inibidores de pequenas moléculas em meios promovem a diferenciação neural e se desenvolvem em células de regiões cerebrais específicas, formando organoides cerebrais maduros.

Para iniciar este procedimento, colete as neuroesferas com uma micropipeta de 200 microlitros, usando uma ponta de 2 milímetros previamente cortada com tesoura estéril. Em seguida, coloque as neuroesferas a aproximadamente 5 milímetros de distância uma da outra em um filme de parafina em um prato de 100 milímetros e remova cuidadosamente o máximo possível do meio restante. Em seguida, adicione uma gota de matriz EHS em cada neuroesfera.

Incube as gotas da matriz EHS com as neuroesferas por 15 minutos a 37 graus Celsius. Depois disso, lave cuidadosamente as neuroesferas do filme de parafina, lavando-as com meio neuroesfera. Posteriormente, incube as neuroesferas pelos próximos quatro dias e adicione 2 mililitros de meio neurosfera fresco no segundo dia.

Neste procedimento, adicione 100 mililitros de meio organoide cerebral a cada frasco giratório através de seus braços laterais e pré-aqueça o meio na incubadora a 37 graus Celsius por pelo menos 20 minutos. Em seguida, certifique-se de que as neuroesferas estejam todas separadas. Se dois ou mais estiverem conectados por meio de matriz EHS, separe-os cortando a matriz de conexão com um bisturi.

Configure um programa de agitação a 25 RPM. Transfira cuidadosamente as neuroesferas embutidas na matriz EHS para os frascos giratórios contendo 100 mililitros de meio organoide. Em seguida, coloque os frascos giratórios em uma plataforma de agitação magnética na incubadora por 14 dias a 37 graus Celsius. Este é o dia zero da cultura organoide. Troque o meio uma vez por semana, removendo metade do meio e adicionando a mesma quantidade de meio fresco.