Uma técnica indireta de co-cultura neurônio-astrócitos para estudar as interações neurônio-glia

Comece com uma placa de vários poços contendo uma inserção de membrana permeável revestida com poli-D-lisina.

Adicione o meio de crescimento de astrócitos ao poço e semeie astrócitos, uma célula glial especializada, na inserção.

Incubar para permitir a adesão celular à poli-D-lisina por meio de interações eletrostáticas e formar uma monocamada.

Substitua o meio astrócitos por um meio de cultura de neurônios.

Transfira esta inserção para uma placa de vários poços contendo neurônios embrionários primários de camundongo aderidos sobre uma lamínula revestida de polímero.

Incubar para estabelecer uma co-cultura indireta de neurônio-astrócitos, onde os dois tipos de células são fisicamente separados, mas compartilham o mesmo meio de cultura.

Os astrócitos secretam vários fatores neurotróficos essenciais para a sobrevivência e o crescimento dos neurônios.

Esses fatores migram através do suporte permeável e interagem com os neurônios primários. Isso promove sua diferenciação e forma projeções neuronais.

Essas projeções se alongam e estabelecem conexões sinápticas entre os neurônios, indicando interações neurônio-glial.

Cubra cada inserto com 10 microgramas por mililitro de poli-D-lisina e incube por uma hora. Após uma hora, lave as inserções duas vezes com PBS.

Enquanto isso, aspire o meio astrócitos e lave a cultura uma vez com 10 mililitros de PBS para garantir que o soro residual seja removido. Em seguida, adicione 3 mililitros de EDTA de tripsina a 0,05% aos frascos e incube as células para tripsinização por aproximadamente 10 minutos. Depois, ressuspenda suavemente as células em 7 mililitros de meio astrócito.

Transferir a suspensão celular para um tubo de 15 mililitros e centrifugar durante cinco minutos a 216 vezes g. Em seguida, aspirar cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 1 mililitro de meio astrócitos. Conte as células usando uma câmara de contagem. Em seguida, encha a placa de 24 poços com 500 microlitros de meio astrócitos por poço. Aspire o PBS e transfira 25.000 células em 500 microlitros de meio astrócitos para cada inserção individual e incube a cultura a 37 graus Celsius.

Para dissecar o hipocampo, prepare três pratos de 10 centímetros cheios de meio de preparação e um tubo de 2 mililitros com 1 mililitro de meio de preparação. Disseque os hipocampos das porções do córtex e colete-os em um tubo de 2 mililitros cheio de meio de preparação.

É fundamental que o hipocampo seja isolado sem nenhum tecido adjacente de outras regiões do SNC. Portanto, após a remoção do hipocampo, os tecidos contaminantes estranhos devem ser removidos adicionalmente.

Após a dissecção, transfira o tubo para uma bancada de fluxo laminar estéril. Remova o meio de preparação com cuidado e digere o tecido hipocampal com 1 mililitro de solução de digestão contendo papaína. Após 15 minutos de digestão, retire cuidadosamente a solução de digestão por sucção suave com uma pipeta.

Devido à alta sensibilidade do neurônio, é fundamental triturar o hipocampo com cuidado para evitar bolhas e obter a intensidade de trituração ideal.

Lave o hipocampo três vezes com meio neural, adicionando e aspirando cuidadosamente 1 mililitro de meio de cultura fresco por ciclo de lavagem. Após a etapa final de lavagem, triturar cuidadosamente o tecido em 1 mililitro de meio neural. Em seguida, conte as células usando uma câmara de contagem. Coloque 35.000 células em 500 microlitros de meio neurônio por poço da placa de 24 poços e incube os neurônios a 37 graus Celsius por uma hora.

Agora, retire da incubadora as inserções preparadas, que foram semeadas com monocamadas de astrócitos confluentes. Troque o meio aspirando o meio astrócitos e substituindo-o por 500 microlitros de meio neurônio fresco.

Em seguida, coloque as inserções com astrócitos cuidadosamente nos poços que contêm as culturas de neurônios usando uma pinça estéril. Posteriormente, coloque a co-cultura de astrócitos de neurônios indiretos resultante de volta na incubadora até os experimentos.