Remoção seletiva de microglia de uma cultura de neurônios de grânulos cerebelares de rato

Pegue um cerebelo de rato colhido e corte-o em pedaços.

Transferir os fragmentos para um tubo contendo tripsina e incubar.

A tripsina digere a matriz extracelular do tecido, soltando os neurônios do grânulo cerebelar, bem como as células não neuronais, como microglia e astrócitos.

Adicione um tampão contendo um inibidor de tripsina e DNase. O inibidor inativa a tripsina enquanto a DNase degrada o DNA contaminante.

Centrifugue e descarte o sobrenadante.

Ressuspenda o tecido em um tampão contendo o inibidor e a DNase e dissocie-o mecanicamente para formar uma suspensão unicelular.

Sobreponha a suspensão a uma solução tampão contendo proteínas.

Centrifugue e descarte o sobrenadante contendo detritos celulares.

Ressuspenda as células no meio e semeie-as em lamínulas revestidas com poli-L-lisina para facilitar a fixação celular.

Remova a mídia. Lave as células com meios frescos e, em seguida, adicione meios contendo um inibidor do ciclo celular para evitar a proliferação de células gliais.

Substitua metade do meio por meio novo contendo um inibidor de lisossomo.

O inibidor tem como alvo seletivo a microglia e rompe as membranas lisossômicas, causando morte e remoção da cultura microglia