Remoção seletiva de microglia de uma cultura de neurônios de grânulos cerebelares de rato

Pegue um cerebelo de rato colhido e corte-o em pedaços.

Transferir os fragmentos para um tubo contendo tripsina e incubar.

A tripsina digere a matriz extracelular do tecido, soltando os neurônios do grânulo cerebelar, bem como as células não neuronais, como microglia e astrócitos.

Adicione um tampão contendo um inibidor de tripsina e DNase. O inibidor inativa a tripsina enquanto a DNase degrada o DNA contaminante.

Centrifugue e descarte o sobrenadante.

Ressuspenda o tecido em um tampão contendo o inibidor e a DNase e dissocie-o mecanicamente para formar uma suspensão unicelular.

Sobreponha a suspensão a uma solução tampão contendo proteínas.

Centrifugue e descarte o sobrenadante contendo detritos celulares.

Ressuspenda as células no meio e semeie-as em lamínulas revestidas com poli-L-lisina para facilitar a fixação celular.

Remova a mídia. Lave as células com meios frescos e, em seguida, adicione meios contendo um inibidor do ciclo celular para evitar a proliferação de células gliais.

Substitua metade do meio por meio novo contendo um inibidor de lisossomo.

O inibidor tem como alvo seletivo a microglia e rompe as membranas lisossômicas, causando morte e remoção da cultura microglial.

Comece este procedimento coletando o cerebelo de filhotes de ratos de quatro a sete dias de idade. Coloque-os imediatamente em uma placa de Petri contendo cinco mililitros de solução A no gelo. Em seguida, remova o excesso de solução do cerebelo e coloque o tecido na tampa da placa de Petri. Em seguida, pique o tecido finamente com uma lâmina de barbear bem inflamada em pelo menos três direções diferentes.

Em seguida, adicione o tecido picado à solução B. Coloque-o em banho-maria a 37 graus Celsius por cinco minutos e agite-o suavemente a cada dois minutos. Em seguida, adicione 20 mililitros da solução D ao tubo para neutralizar a tripsina. Agitar e centrifugar a 65 g durante cinco minutos. Depois, despeje o sobrenadante. Ressuspendê-lo em quatro mililitros da solução C.

Triturar a amostra 10 vezes com cada uma das três pipetas de vidro flamejado de diâmetro decrescente até que a suspensão seja o mais homogénea possível. Em seguida, adicione lenta e suavemente algumas gotas deste homogeneizado em cima do BSA-EBSS. Se começar a afundar no BSA-EBSS, triture mais e adicione um pouco mais de solução C. O homogeneizado deve ficar em uma camada sobre o BSA-EBSS.

Gire a 100 g por cinco minutos e não agite. Em seguida, remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento num mililitro de meio MEM. Conte as células usando um hemocitômetro e coloque-as em placas a 800.000 células por lamínula em 500 microlitros de meio MEM. Depois disso, coloque-os em uma incubadora a 37 graus Celsius com 6% de dióxido de carbono. Em seguida, faça uma solução de meio MEM contendo 10 micromolares do inibidor do ciclo celular, AraC.

Para cada lamínula, retenha 250 microlitros do meio antigo em uma placa nova de 24 poços e aspire o restante. Adicione 250 microlitros de meio MEM normal para lavar as células. Posteriormente, adicione 250 microlitros de meio antigo de volta às células e complete com 250 microlitros de meio contendo AraC.

Neste procedimento, adicione LME puro a cinco mililitros de meio MEM para obter uma concentração final de 150 milimolares LME. Retorne a solução a pH 7,4 usando solução ácido-base. Em seguida, filtre-o estéril usando um PES de 28 milímetros com filtro de seringa de 0,2 micrômetro.

Em seguida, diluir a solução LME a uma concentração de 50 milimolares em meio MEM. Em seguida, coloque-o em banho-maria a 37 graus Celsius por 10 minutos, junto com o meio MEM normal para culturas de controle. Após 10 minutos, remova 250 microlitros do meio MEM de cada cultura CGC. Em seguida, mantenha a mídia a 37 graus Celsius.

Em seguida, trate as células com meio MEM contendo duas vezes LME ou com meio MEM pré-aquecido sem LME para culturas de controle. Incube as células a 37 graus Celsius em uma atmosfera umidificada com 6% de dióxido de carbono por uma hora. Em seguida, lave as células duas vezes em meio MEM fresco pré-aquecido para remover o meio contendo LME.

Em seguida, substitua o meio de cultura retido por uma quantidade igual de meio MEM fresco pré-aquecido. Por fim, incube as culturas em dióxido de carbono umidificado a 6% a 37 graus Celsius.