Impressões Digitais de DNA de Mycobacterium leprae Estirpes Usando Repita Tandem número variável (VNTR) - Análise Fragmento (FLA)

O objetivo geral deste procedimento é desenvolver uma impressão digital de DNA distintiva de Mycobacterium leprae, a bactéria não cultivável que causa a hanseníase, diretamente a partir de espécimes clínicos. O DNA bacteriano de M. leprae, extraído de biópsias de pacientes, é amplificado por meio de PCR multiplex utilizando primers fluorescentes específicos para locos de repetições em tándem de número variável, ou VNTR. Após a amplificação do DNA, realiza-se eletroforese capilar para análise de tamanho de fragmentos.

Os dados são analisados para determinar o número de segmentos de DNA com repetições em tandem curtas em cada locus. Como diferentes cepas de EPRI apresentam números distintos de repetições em tandem em cada locus, dados de múltiplos loci produzem perfis de DNA únicos, e um banco de dados dos tipos de cepas dos pacientes pode ser gerado usando esta técnica.

A estrutura populacional, evolução e transmissão da hanseníase entre pacientes em comunidades definidas e em escala global podem ser caracterizadas, fornecendo, em última instância, ferramentas genéticas e evidências para a eliminação da hanseníase. Este método pode ser utilizado para rastrear a disseminação da hanseníase, identificar agrupamentos de infecções recentes e indivíduos em risco, além de medir a eficácia de programas controlados. Demonstrarão o procedimento Lee e Ron Jensen, pesquisadores do meu laboratório, e Jason Rivers, da nossa instalação central de instrumentação. Extraia o DNA de biópsias clínicas utilizando um kit padrão de extração de DNA KaiGen.

Uma vez que o DNA tenha sido obtido, prepare uma nova área de trabalho dentro de um gabinete PCR limpo. Para evitar qualquer contaminação de DNA, limpe o gabinete e um conjunto de pipetas com etanol 70% e exponha o gabinete e as pipetas à luz UV por 15 minutos. Após o gabinete estar limpo, pode-se montar a PCR multiplexa; para cada PCR multiplexa, utilize quatro a cinco pares de primers, nos quais um primer de cada par é marcado fluorescentemente.

Deve ser misturado. Use estoques de *primers* a 10 micromolares preparados em tampão TE para fazer as misturas de *primers*, misturando quantidades iguais de todos os *primers* diretos ou superiores em um tubo Eppendorf, de modo a obter uma concentração final de dois micromolares. Para cada *primer*, adicione tampão TE se necessário.

Em outro tubo, misture todos os primers reversos ou inferiores da mesma maneira. Uma vez que as misturas de primers tenham sido preparadas, prepare a mistura PCR MES. Crie um mapa de placa identificado com todas as amostras e controles por amostra.

A mistura mestra deve conter 12 microlitros da mistura de PCR multiplex KaiGen, dois microlitros de cada pool de iniciadores e dois microlitros da solução Q. Certifique-se de preparar quantidade suficiente da mistura mestra para incluir os controles e compensar perdas durante a pipetagem. Centrifugue brevemente a mistura mestra.

A seguir, alíquota 18 microlitros da mistura mestra em cada poço de uma placa de PCR. Para evitar a contaminação das amostras de DNA, troque as luvas, limpe e desinfete um gabinete de segurança biológica separado. Como antes, uma vez que a câmara de fluxo laminar tiver sido descontaminada, transfira a placa para essa câmara.

Em seguida, adicione dois microlitros da amostra de DNA a cada poço contendo a mistura mestra. Certifique-se de usar ponteiras de pipeta com proteção contra aerossóis para evitar contaminação cruzada. Selle cuidadosamente as placas de PCR e centrifugue brevemente para misturar o conteúdo.

Em seguida, coloque a placa de reação no termociclador e inicie o programa de PCR para submissão das amostras. Para FLA, prepare o formato de amida para análise de tamanho, a mistura mestra e adicione os produtos de PCR diluídos em um tubo eppendorf limpo combinando 12 microlitros de solução de formamida desidratada e 0,3 microlitros do padrão de dimensionamento GeneScan 500 por amostra a ser testada. Aliquote 12,3 microlitros dessa solução por poço em uma placa de reação de 96 poços de qualidade óptica.

Após a conclusão da PCR, a placa é centrifugada. Certifique-se de que a posição de cada amostra seja registrada no mapa da placa. Em seguida, em uma placa separada de 96 poços, distribua 59 microlitros de água livre de nucleases por poço e adicione um microlitro de cada reação de PCR por poço para diluir o DNA amplificado na proporção de 1 para 60.

Uma vez que o DNA tenha sido diluído, utilize uma pipeta multicanal para transferir um microlitro de cada amostra de PCR diluída para o poço correspondente da placa contendo a solução livre de formamida. Após a conclusão do programa, as amostras podem ser testadas por eletroforese em gel de agarose padrão para confirmar que os fragmentos de DNA de tamanhos previstos foram amplificados neste ponto. As amostras são preparadas para análise por eletroforese capilar fluorescente utilizando um analisador genético FLA; antes da análise, adicione um septo à placa e centrifugue brevemente para remover bolhas de ar e fazer com que a amostra desça até o fundo do poço.

O IDE irá desnaturar quimicamente as fitas, portanto não é necessário o desnaturamento por calor. Coloque a placa em uma bandeja de carga. Avalie o produto da PCR marcado utilizando eletroforese capilar, como o analisador genético ABBI'S 3130 xl.

Analise as amostras utilizando um capilar de 50 centímetros preenchido com o polímero POP-7 como meio separador. O DNA migra em direção à extremidade do capilar, onde um laser e um detector medem as marcas fluorescentes; abra o software de coleta do analisador. Será necessário calibrar o analisador para detectar todas as tintas utilizadas antes da execução das amostras, incluindo o padrão de tamanho — o dset usado para essas amostras é o G5 da ABI. As amostras são injetadas eletrocineticamente a 1,6 quilovolts durante 15 segundos.

Sequencie os fragmentos aplicando 15 quilovolts durante 1800 segundos. O tempo total de cada corrida é de aproximadamente 45 minutos. Após o término da corrida, crie arquivos de dados para cada amostra.

Os arquivos são colocados em uma pasta de placa pelo software de coleta do analisador em um local predeterminado. Os arquivos estão no formato FSA. Os dados FLA podem ser analisados usando o software peak scanner, que está gratuitamente disponível no site da Applied Biosystems.

Para analisar os dados, clique em iniciar novo projeto, seguido por adicionar arquivos. Carregue os arquivos de dados selecionados no programa, incluindo os controles positivo e negativo. Selecione e analise os arquivos carregados.

Os resultados são apresentados como um cromatograma FLA. Os padrões de dimensionamento aparecem como picos laranja, enquanto os picos coloridos representam as amostras de DNA bacteriano para cada locus analisado na amostra; clique em um pico para determinar seu tamanho em pares de bases. Devido à síntese por escorregamento da fita pela DNA polimerase, uma família de picos da mesma cor será detectada em alguns loci de microssatélites.

Nesses casos, o pico selecionado geralmente é o de maior amplitude. Compare os tamanhos dos fragmentos em cada amostra com o tamanho do controle positivo para determinar quantos segmentos de repetições em tandem estão presentes para cada alelo testado e registre os dados em uma planilha do Excel para análise posterior. Nesta figura, são mostrados os perfis de DNA de isolados de sete pacientes pertencentes a três famílias diferentes de uma mesma aldeia, e o número de repetições em tandem para cada locus polimórfico analisado é indicado.

Esses dados sugerem que dois membros da família B estão infectados com a mesma cepa, enquanto um membro está infectado com uma cepa distinta. Os membros das famílias C provavelmente estão infectados com a mesma cepa. O mesmo ocorre com os membros da família A. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como incluir rotineiramente a PCR multiplex e a análise de comprimento de fragmento para obter perfis de DNA-V-N-T-R para pacientes de hanseníase que se apresentam nas clínicas.

Essas são ferramentas moleculares novas que complementam a epidemiologia convencional no controle da hanseníase.