Gerando uma cultura neuronal de densidade ultrabaixa usando uma camada alimentadora neuronal de alta densidade

Comece com duas placas de vários poços: uma com um fundo gravado revestido com um polímero e a outra com uma lamínula revestida com polímero.

Semeie uma suspensão de alta densidade dos neurônios embrionários na placa com o fundo gravado. Adicione uma suspensão de neurônios de densidade ultrabaixa à lamínula que contém bem.

Incubar para permitir a ligação neuronal aos polímeros.

Remova a lamínula e coloque-a sobre a cultura de neurônios de alta densidade, permitindo que os neurônios fiquem de frente um para o outro.

A superfície gravada com estruturas elevadas cria um microespaço que separa neurônios de diferentes densidades.

A cultura de alta densidade atua como uma camada alimentadora e secreta o fator de crescimento neural.

Devido ao espaço de difusão confinado, os fatores de crescimento se acumulam ao redor dos neurônios, facilitando seu crescimento e o desenvolvimento de projeções neuronais.

Introduzir um meio neurobasal com arabinosídeo citosina que inibe seletivamente o crescimento das células não neuronais.

Reabasteça regularmente com um meio neurobasal fresco para manter a cultura neuronal.

Neste procedimento, coloque placas de 24 poços com fundos gravados para neurônios de alta densidade na capela de cultura. Remova 300 microlitros do meio pré-condicionado por vácuo. Em seguida, coloque 0,6 mililitros de suspensão de células de alta densidade a 250.000 neurônios por mililitro.

Coloque as outras placas de 224 poços com lamínulas na coifa de cultura. Remova 300 microlitros do meio pré-condicionado por vácuo, antes de plaquear 0,6 mililitros de suspensão de células de baixa densidade a 10.000 neurônios por mililitro nas lamínulas. Depois, devolva todas as placas de 24 poços para a incubadora e incube por duas horas. Depois disso, vire as lamínulas de baixa densidade com os neurônios aderentes à cultura de alta densidade e certifique-se de que os neurônios estejam voltados um para o outro. Em seguida, devolva as duas placas com cocultura à incubadora.

Alimente as co-culturas adicionando 300 microlitros de meio de alimentação fresco no DIV 5. Após esta alimentação inicial, adicione 300 microlitros de meio de alimentação fresco sem arabinosídeo de citosina a cada poço todas as semanas. Se a cultura for mantida por mais de um mês, substitua metade do meio por meio de alimentação fresco todas as semanas, além de um mês.