Diferenciando células progenitoras neurais induzidas em astrócitos

Faça uma cultura de células progenitoras neurais induzidas, ou iNPCs, em uma placa de vários poços revestida com proteína de matriz extracelular.

Substitua o meio por meio de indução glial e incuba. Fatores de crescimento e hormônios na mídia facilitam a diferenciação do iNPC em células precursoras gliais.

Troque a mídia a cada dois dias para proliferação celular. Em seguida, substitua a mídia por mídia de astrócitos e incuba.

Nutrientes específicos e fatores de crescimento no meio impulsionam a diferenciação das células precursoras gliais em astrócitos.

Mudanças na mídia a cada dois dias promovem a maturação dos astrócitos.

Mude o meio para neuro-diff-medium quando as células estiverem aproximadamente 70% confluentes e continue a mudar o meio em dias alternados por três semanas. Não divida as células durante a diferenciação. Após três semanas, as células devem expressar o marcador neuronal TuJ1.

Para obter neurônios e subtipos neuronais mais maduros, continue a diferenciação por até três meses. Para diferenciação de iNPCs especificamente para uma linhagem glial, mude o meio para meio de indução glial, incluindo 20 nanogramas por mililitro de fator de crescimento epidérmico para induzir a diferenciação em células precursoras gliais. Remova metade do meio e substitua por meio novo a cada dois dias por cerca de duas semanas.

Durante este período, as células devem ser divididas de 1 a 3 na presença de inibidor de Rhoquinase 10 micromolares quando 100% de confluência for atingida. Após duas semanas, diferencie ainda mais as células em astrócitos, mudando o meio para o meio de astrócitos disponível comercialmente quando as células estiverem quase confluentes e continuando a mudar o meio a cada dois dias. Aproximadamente sete dias depois, as células começam a expressar marcadores de astrócitos.