Dissociação e cultura de neurônios de amostras de tecido hipocampal
JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurociência
0 vistas • 3:35 min • July 8th, 2025
Comece com amostras de tecido hipocampal contendo neurônios e várias células não neuronais.
Adicione uma solução enzimática de protease. A enzima degrada a matriz extracelular do tecido, iniciando a dissociação celular.
Lave com um meio de revestimento para remover as enzimas residuais.
Pipetar o tecido digerido repetidamente para dissociar mecanicamente as células do tecido, formando uma suspensão unicelular.
Centrifugue e remova o sobrenadante. Ressuspenda as células no meio de revestimento.
Semeie as células em uma lamínula revestida com poli-D-lisina em uma placa de vários poços. A lisina aumenta a ligação celular.
Substitua o meio de revestimento por um meio de manutenção de neurônios contendo nutrientes essenciais para a sobrevivência dos neurônios.
Atualize metade do meio com meios de manutenção contendo arabinosilcitosina ou Ara-C.
Ara-C entra nas células e inibe seletivamente o crescimento de células não neuronais, levando à sua morte.
Substitua o meio por um novo meio de manutenção para apoiar a sobrevivência dos neurônios.
Para dissociar os neurônios do hipocampo para cultura, descongele a solução enzimática de protease e pré-aqueça o meio de plaqueamento a 37 graus Celsius. Em seguida, enxágue o hipocampo dissecado com SLDS. Em seguida, remova-o e adicione 2 mililitros de solução enzimática de protease e incube a amostra a 37 graus Celsius por 15 minutos.
Em seguida, lave os explantes do hipocampo com 5 a 10 mililitros de meio de revestimento duas vezes e adicione 5 mililitros de meio de revestimento. Dissocie os explantes do hipocampo em células únicas, gerando um pequeno vórtice usando uma pipeta com uma ponta de plástico de 1 mililitro. Pipete para cima e para baixo cerca de 40 vezes, evitando a formação de bolhas de oxigênio até que a solução fique turva e não restem grandes pedaços de explante.
Em seguida, centrifugue as células a 1.125 vezes a gravidade por 3 minutos. Remova o sobrenadante com as células submersas no meio e ressuspenda as células em 145 mililitros de meio de revestimento. Em seguida, adicione 1 mililitro da suspensão celular por poço a uma placa de 24 poços. Incube as células no meio de plaqueamento a 37 graus Celsius por duas a quatro horas.
Em seguida, remova o meio de revestimento e substitua-o por um novo meio de manutenção. Após dois dias, substitua metade do meio por dois Ara-C micromolares dissolvidos em meio de manutenção para inibir o crescimento de fibroblastos, células endoteliais e gliais. Em seguida, depois de expor as células ao Ara-C por dois dias, substitua o meio por um novo meio de manutenção.
Visão Geral
Este artigo detalha o processo de dissociação de neurônios do hipocampo a partir de amostras de tecido para cultivo. Descreve as etapas envolvidas no preparo das células para manutenção e crescimento in vitro.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Cultura Celular
- Biologia Neuronal
Antecedentes
- Neurônios do hipocampo são fundamentais para o estudo de diversas funções neurológicas.
- Técnicas de dissociação celular são essenciais para o isolamento de neurônios a partir de células não neuronais.
- A manutenção adequada de culturas neuronais é vital para a precisão experimental.
- O uso de Ara-C auxilia na inibição seletiva do crescimento de células não neuronais.
Objetivo do Estudo
- Fornecer uma metodologia detalhada para o isolamento de neurônios do hipocampo.
- Aprimorar a compreensão das técnicas de cultura de células neuronais.
- Melhorar a sobrevivência e a manutenção de neurônios em cultura.
Métodos Utilizados
- Preparação de amostras de tecido hipocampal.
- Uso de solução enzimática de protease para dissociação do tecido.
- Dissociação mecânica para obter uma suspensão de células isoladas.
- Aplicação de Ara-C para inibir o crescimento de células não neuronais.
Resultados Principais
- Dissociação bem-sucedida de neurônios a partir de tecido hipocampal.
- Manutenção eficaz de culturas neuronais ao longo do tempo.
- Demonstração de inibição seletiva de células não neuronais utilizando Ara-C.
- Estabelecimento de um protocolo confiável para estudos futuros.
Conclusões
- O protocolo permite o isolamento e cultivo eficientes de neurônios hipocampais.
- A utilização de Ara-C é crucial para manter a pureza neuronal.
- Essa metodologia pode ser aplicada a diversos estudos em neurociência.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A dissociação confiável e o cultivo de neurônios do hipocampo permitem a criação de sistemas padronizados, enriquecidos em neurônios, para a descoberta precoce de fármacos em neurociência. Esses cultivos fornecem uma plataforma controlada para investigar mecanismos neuronais, apoiando a confiança preditiva na validação de alvos e na redução de riscos mecanicistas. A seletividade do método para populações neuronais aumenta a continuidade translacional e a tomada de decisões em portfólios dentro de fluxos voltados à neurobiologia.
Aplicações Estratégicas em P&D Biofarmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite o isolamento de populações neuronais puras para estudos orientados por hipóteses.
- Apóia a desmistificação mecanicista ao minimizar fatores de confusão não neuronais.
- Facilita a validação funcional de alvos em sistemas neuronais relevantes para doenças.
- Melhora a confiança preditiva para triagem inicial de portfólios.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Fornece culturas de neurônios reprodutíveis para padronização de ensaios.
- Permite a medição quantitativa das respostas neuronais a compostos.
- Oferece suporte à escalabilidade e reutilização da plataforma para campanhas de triagem.
- Reduz a variabilidade limitando a interferência de células não neuronais.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha modelos in vitro com a biologia neuronal relevante para a doença.
- Apoia a continuidade desde a descoberta até a validação pré-clínica.
- Permite decisões de avanço ajustadas ao risco com base em dados específicos de neurônios.
- Facilita a exploração de biomarcadores em sistemas enriquecidos com neurônios.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este protocolo de dissociação e cultivo de neurônios situa-se na interface entre a descoberta inicial e o desenvolvimento de ensaios, fornecendo sistemas fundamentais para triagens subsequentes e estudos mecanicistas.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a clarificação de vias em contextos específicos de neurônios.
- Triagem: Fornece ensaios neuronais quantitativos e reprodutíveis para avaliação de compostos.
- Análises: Permite a medição da viabilidade e resposta neuronais, apoiando comparações estatísticas entre diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Oferece uma transição para modelos pré-clínicos ao manter a pureza e relevância neuronais.
- Reutilização Empresarial: Estabelece um fluxo de trabalho padronizado e adaptável a diversos projetos de neurobiologia.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista em estudos neuronais.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização, reprodutibilidade e escalabilidade dos fluxos de trabalho de cultivo de neurônios.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguimento ou interrupção e a eficiência do capital ao permitir ensaios neuronais robustos.
- Impacto sobre o Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco e o avanço de ativos em neurobiologia.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência no manuseio de tecido neuronal e técnicas de cultura celular.
- Exige acesso a soluções enzimáticas de protease, placas revestidas com poli-D-lisina e ambientes de incubação controlados.
- Exige padronização entre equipes para reprodutibilidade em estudos multicêntricos.
- Pode ser necessária adaptação para diferentes subtipos neuronais ou espécies.
- Depende da remoção eficaz de células não neuronais para desempenho ideal do ensaio.
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Última atualização: 29 agosto 2026