Dissociação e cultura de neurônios de amostras de tecido hipocampal

Comece com amostras de tecido hipocampal contendo neurônios e várias células não neuronais.

Adicione uma solução enzimática de protease. A enzima degrada a matriz extracelular do tecido, iniciando a dissociação celular.

Lave com um meio de revestimento para remover as enzimas residuais.

Pipetar o tecido digerido repetidamente para dissociar mecanicamente as células do tecido, formando uma suspensão unicelular.

Centrifugue e remova o sobrenadante. Ressuspenda as células no meio de revestimento.

Semeie as células em uma lamínula revestida com poli-D-lisina em uma placa de vários poços. A lisina aumenta a ligação celular.

Substitua o meio de revestimento por um meio de manutenção de neurônios contendo nutrientes essenciais para a sobrevivência dos neurônios.

Atualize metade do meio com meios de manutenção contendo arabinosilcitosina ou Ara-C.

Ara-C entra nas células e inibe seletivamente o crescimento de células não neuronais, levando à sua morte.

Substitua o meio por um novo meio de manutenção para apoiar a sobrevivência dos neurônios.

Para dissociar os neurônios do hipocampo para cultura, descongele a solução enzimática de protease e pré-aqueça o meio de plaqueamento a 37 graus Celsius. Em seguida, enxágue o hipocampo dissecado com SLDS. Em seguida, remova-o e adicione 2 mililitros de solução enzimática de protease e incube a amostra a 37 graus Celsius por 15 minutos.

Em seguida, lave os explantes do hipocampo com 5 a 10 mililitros de meio de revestimento duas vezes e adicione 5 mililitros de meio de revestimento. Dissocie os explantes do hipocampo em células únicas, gerando um pequeno vórtice usando uma pipeta com uma ponta de plástico de 1 mililitro. Pipete para cima e para baixo cerca de 40 vezes, evitando a formação de bolhas de oxigênio até que a solução fique turva e não restem grandes pedaços de explante.

Em seguida, centrifugue as células a 1.125 vezes a gravidade por 3 minutos. Remova o sobrenadante com as células submersas no meio e ressuspenda as células em 145 mililitros de meio de revestimento. Em seguida, adicione 1 mililitro da suspensão celular por poço a uma placa de 24 poços. Incube as células no meio de plaqueamento a 37 graus Celsius por duas a quatro horas.

Em seguida, remova o meio de revestimento e substitua-o por um novo meio de manutenção. Após dois dias, substitua metade do meio por dois Ara-C micromolares dissolvidos em meio de manutenção para inibir o crescimento de fibroblastos, células endoteliais e gliais. Em seguida, depois de expor as células ao Ara-C por dois dias, substitua o meio por um novo meio de manutenção.