Name: Transplante de Células-tronco Estratégias para a Restauração da disfunção cognitiva causada pela radioterapia craniana (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: Aprenda a transplantar células-tronco no hipocampo de ratos atímicos após radioterapia craniana. Este método demonstra a migração celular e oferece uma estratégia para restaurar a função cognitiva comprompida pela radiação.

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Este trabalho foi financiado pelo NIH NINDS conceder R01 NS074388 581 (CL Limoli), Instituto da Califórnia de Medicina Regenerativa (CIRM) Grant RS1-00413 (CLL), Formação CIRM Grant TG2-0115 (MMA), e um Grant CIRM para JOVE em apoio da documentação de vídeo.

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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Considerável pesquisa está em andamento a explorar a miríade de formas que as células-tronco pode ser usada clinicamente para restaurar as funções normais de tecidos danificados, com idades entre 8 e doentes. A eventual realização desses esforços exigirá uma compreensão detalhada do comportamento das células enxertadas dentro microambientes únicos que são distintos de tecido normal intacta. Nosso trabalho demonstrou que dentro do leito tecido irradiado, NSCs cranialmente enxertada pode restaurar funcionalmente cognição, onde sobrevivem, migram e se diferenciam ao longo de linhagens neuronais e gliais 2. Precisamente como estas células mediar a recuperação da cognição é incerto no momento, mas não depende de realização de uma série de procedimentos experimentais cuidadosamente controladas de maneira reprodutível. Temos detalhada desses procedimentos crítica aqui em esforços para acelerar o potencial de translação de terapias com células-tronco para amenizar efeitos adversos cognitivos associados com amanejo clínico do cérebro e outras formas de câncer. Considerações adicionais que são susceptíveis de ter um impacto significativo da qualidade dos dados são destacadas a seguir. Terapias de transplante com base dependem de células-tronco como o reagente crítico, e, consequentemente, o cuidado deve ser exercido de forma adequada caracterizar culturas, manter a esterilidade e usar números passagem pareados por fiabilidade dos resultados. Transplantadas células-tronco humanas foram marcadas com BrdU antes da cirurgia, para fornecer um meio para segui-los in vivo. Nas nossas condições experimentais, NSCs transplantadas não foram submetidos a proliferação extensiva, de modo que a diluição do rótulo BrdU não era problemático. Alternativamente, transplantaram células-tronco humanas podem ser distinguidas das células do hospedeiro por imunomarcação para marcadores específicos humanos tais como a proteína da matriz nuclear (h-NUC ou hNUMA) 9 ou humana antígeno específico nuclear (HuNu) 2. Células-tronco humanas também podem ser rotulados comuma variedade de marcadores fluorescentes para facilitar a sua identificação dentro do cérebro host. Atenção a parâmetros de irradiação definir técnicas de entrega precisos dose, e aquelas aqui descritas modelo atual prática clínica em oncologia de radiação. O transplante de células-tronco reprodutível no cérebro também é crítica, e é realizado através de um instrumento digital estereotáxico. A capacidade de micromanipulate precisamente de uma seringa para a implantação de micro-células-tronco em pequenas estruturas cerebrais como o hipocampo reduz o erro humano. Com este aparelho, NSCs foram transplantadas em quatro locais distintos abrangendo o anterior para regiões posteriores do hipocampo de ratos. Dorso-ventral (DV) coordenadas foram determinadas com base na experiência com atímicos nude (ATN) ratos de tal forma que os procedimentos cirúrgicos não causaria danos à formação do hipocampo 2. A secção coronal através do cérebro do rato revela estruturas fundamentais da formação hipocampal including giro denteado (DG), o hilo denteado (DH) e CA1 e CA3 subcampos (Fig. 8). NSCs transplantados, introduzida dorsalmente a partir do trato agulha visível (Nt, redline), são visualizadas como coloração escura (marrom) células depositadas no site de transplante de liberação (Tr), logo abaixo do corpo caloso (CC), que, posteriormente, migrar todo o septo -temporal eixo do hipocampo.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do material </td><td> Tipo </td><td> Companhia </td><td> Número Catálogo </td><td> Comentário </td></tr><tr><td> Digital Instrumento estereotáxica w/45 ° e 18 ° Earbars </td><td> Configuração craniana transplante cirúrgico </td><td> Leica Microsystems (anteriormente: MyNeuroLab) </td><td> 39463501 </td><td> Acessórios úteis: Palco com aquecedor e fonte de corrente variável (para manter a temperatura corporal durante a cirurgia) </td></tr></tbody></table>

transplante de células-tronco estratégias para a restauração da disfunção cognitiva causada pela radioterapia craniana

Stem Cell Transplantation Strategies for the Restoration of Cognitive Dysfunction Caused by Cranial Radiotherapy

Radioterapia geralmente fornece o único recurso clínico para os que sofrem com tumores cerebrais primários ou metastáticos. Apesar de benéfico, irradiação craniana pode induzir um declínio progressivo na cognição e debilitante que pode, em parte, ser causada pela depleção de células-tronco neurais. Dado o aumento da sobrevida de pacientes diagnosticados com câncer no cérebro, qualidade de vida em termos de saúde cognitiva tornou-se uma preocupação crescente, especialmente na ausência de qualquer satisfatória tratamentos de longo prazo. Para resolver este grave problema de saúde que temos utilizado a substituição de células-tronco como uma estratégia para combater a radiação induzida por declínio cognitivo. Nosso modelo utiliza ratos atímicos nu submetidos a irradiação craniana. A radiação ionizante é entregue como quer a totalidade do cérebro ou como um feixe altamente focalizado para o hipocampo através de lin orelha de um ccelerator (LINAC) radiocirurgia estereotáxica base. Dois dias após a irradiação, hucélulas-tronco neurais homem (hNSCs) foram transplantadas para o stereotaxically hipocampo. Os ratos foram então avaliados para alterações na cognição sobrevivência da célula, enxertadas e para a expressão de marcadores de diferenciação específicos 1 e 4 meses após a irradiação. Nossos paradigmas testes cognitivos têm demonstrado que os animais enxertados com hNSCs apresentam melhoras significativas na função cognitiva. Estereologia imparcial revela sobrevida significativa (10-40%) das células enxertadas em 1 e 4 meses após o transplante, depende da quantidade e do tipo de células enxertadas. Enxertada células migram extensivamente, ao longo diferenciar linhagens glial e neuronal, e expressar uma gama de imaturos e maduros marcadores fenotípicos. Nossos dados demonstram direto benefícios cognitivos derivados de células-tronco humanas em vós enxertada, sugerindo que este procedimento poderá um dia pagar uma estratégia promissora para a restauração de longo prazo funcionais da cognição em indivíduos submetidos a radiot cranialherapy. Promover a divulgação dos procedimentos de crítica necessária para replicar e estender os nossos estudos, nós fornecemos a documentação escrita e visual dos vários passos-chave em nosso plano experimental, com ênfase em estereotáxica radiosurgey e transplante.

Pacientes com tumor cerebral rotineiramente submetidos à radioterapia cranial, e ao mesmo tempo benéfico, este tratamento muitas vezes resulta em disfunção cognitiva debilitante. Este grave problema por resolver tem no momento, nenhum recurso clínico, e tem impulsionado os nossos esforços para desenvolver terapias com células-tronco com base para a recuperação de induzida por radiação decrementa cognitiva.

Transplante de Células-tronco Estratégias para a Restauração da disfunção cognitiva causada pela radioterapia craniana

A radioterapia frequentemente constitui o único recurso clínico para aqueles acometidos por tumores cerebrais primários ou metastáticos. Embora seja benéfica, a irradiação craniana ...

O objetivo geral do experimento a seguir é transplantar células-tronco de forma reprodutível no hipocampo. Primeiro, ratos atímicos são submetidos à radioterapia estereotáxica, simulando o que poderia ocorrer durante o manejo clínico do câncer cerebral. No laboratório, células-tronco neurais humanas são cultivadas para transplante, sendo que normalmente são necessárias 1 milhão de células para o tratamento de um único rato.Dois dias após a irradiação, as células-tronco são injetadas lentamente no hipocampo em uma localização precisa. Em última análise, o protocolo mostra a migração das células-tronco transplantadas por todo o hipocampo. Tive a ideia inicial dessas metodologias quando comecei a considerar as perspectivas de usar células-tronco para reverter a inibição da neurogênese após irradiação craniana. Geralmente, indivíduos familiarizados com este método enfrentarão dificuldades, pois o crescimento de células-tronco não é trivial e exige atenção e cuidados diários em condições de crescimento livres de antibióticos.A demonstração visual deste procedimento desmistificará o processo clínico utilizado para a reconstrução de imagens na irradiação precisa de pequenos volumes cerebrais bem definidos. O procedimento de irradiação será demonstrado pelo Dr. Dante Rowa, professor clínico do meu departamento. A preparação de células-tronco será demonstrada pelas técnicas do meu laboratório, Sra. Mary Land e Catherine Tran, e o Dr. Muja, pesquisador pós-doutorando, demonstrará os procedimentos necessários para o transplante.Utilizamos um software de radioterapia guiada por imagem para posicionamento preciso do animal antes do tratamento e radioterapia modulada para irradiação direcionada com dano mínimo por radiação em outras partes do cérebro. 24 horas após uma ressonância magnética, gere outro volume de imagens em corte transversal posicionando o animal sedado em um scanner de tomografia computadorizada de radiologia oncológica. Posicione o rato na mesma posição utilizada para a ressonância magnética e configure a unidade de TC para escanear a região do crânio, gerando os dados para planejamento do tratamento de radioterapia.Obtenha 106 imagens de TC com uma espessura de imagem de 0,8 milímetro. Em seguida, transfira os dados das imagens de ressonância magnética e de TC para o software de planejamento de tratamento Eclipse. Use o Eclipse para fundir os dados de ressonância magnética e de TC com base na anatomia óssea e no alinhamento de tecidos moles.Esta é uma etapa com variável de tempo e, dependendo da qualidade da imagem, esse processo pode levar de uma a três horas. Após obter uma fusão de imagens satisfatória, delimite as regiões-alvo a serem irradiadas, bem como os órgãos críticos adjacentes. A irradiação pode ser administrada em todo o cérebro ou restrita a regiões volumétricas específicas, como os hipocampos individuais.Os contornos fornecem não apenas a localização desses órgãos, mas também informações de volume que serão fundamentais para ajustar a distribuição da dose. Para ajustar a distribuição da dose, insira informações sobre a dose alvo, conformidade do alvo e restrições de dose para órgãos críticos na janela de otimização de dose no eclipse.Uma vez gerado um plano, o Eclipse fornece a dose calculada sobreposta às imagens axiais, coronais e sagitais, bem como no formato de histograma de volume-dose. É nesse momento que o plano deve ser avaliado para determinar se é adequado para administração ou se precisa ser aprimorado. Para iniciar o processo de irradiação, posicione uma rata anestesiada sob um cobertor de papel para mantê-la aquecida.Após alguns minutos, coloque o rato sobre a mesa de tratamento do acelerador linear de radioterapia coberta com o cobertor, mas com o crânio exposto. Certifique-se de posicioná-lo na mesma posição utilizada para gerar a tomografia computadorizada. Este passo é essencial para garantir a precisão na administração da dose.Em seguida, adquira imagens ortogonais de raios X dos ratos sedados utilizando o sistema de imagem embutido no acelerador linear de radioterapia, coregistre as imagens ortogonais de raios X a um conjunto de imagens de referência fornecido pelo Eclipse e prossiga com a aplicação das correções de posição necessárias para um alinhamento adequado das imagens. Administre a irradiação como uma dose dividida em 10 frações, utilizando um plano de IMRT com seis campos para um único hipocampo e um plano de arco rápido com dois arcos para a irradiação de ambos os hipocampos. Após a conclusão da administração do tratamento, remova o animal da sala de tratamento e permita que ele se recupere em uma gaiola térmica de contenção.Para se preparar para a cirurgia, use tesouras elétricas para remover o pêlo da cabeça de um rato A TN anestesiado. Limpe a área depilada com aplicações repetidas de iodopovidona e etanol a 70%, trabalhando dentro de uma cabine de fluxo laminar. Prepare os instrumentos estereotáxicos, a broca micrométrica, o esterilizador de leito seco e os controladores.Mantenha o animal aquecido durante a cirurgia colocando-o sobre uma superfície aquecida. Luvas estéreis são usadas antes e durante toda a cirurgia e pulverizadas com etanol 70%. O equipamento cirúrgico é mantido em uma câmara de fluxo laminar dedicada.Para manter condições assépticas, cubra o animal com um pequeno campo cirúrgico de forma que apenas a cabeça fique exposta. Posicione firmemente a cabeça do animal dentro do estereotáxico inserindo hastes auriculares no meato auditivo externo. Tenha extrema cautela ao deslizar a ponta da haste auricular para dentro do canal auditivo.Posicione a barra incisiva encaixando os incisivos superiores da rata e ajustando a altura da barra até o ponto de referência padrão. Em seguida, aperte o prendedor nasal. Centralize a posição da cabeça entre as barras auriculares com movimento lateral mínimo para atingir o zero estereotáxico.Após posicionar o animal, aplique pomada lubrificante nos olhos para prevenir ressecamento. Aplique a pomada mais uma vez durante a cirurgia. Usando um bisturi estéril, faça uma incisão mediana de dois centímetros na pele ao longo do couro cabeludo.Limpe a área utilizando um aplicador estéril de algodão. Em seguida, insira um retrator cirúrgico para manter o periósteo aberto. Aplique pressão firme na área caso ocorra sangramento.Usando um aplicador de algodão mergulhado em peróxido de hidrogênio a 1%, remova os tecidos moles que cobrem o crânio até que as suturas bgma e lambda fiquem visíveis. O aspecto mais difícil da cirurgia estereotáxica é o posicionamento preciso da cabeça do animal no aparelho estereotáxico. Para marcar coordenadas estereotáxicas precisas no crânio do animal, utilize um atlas cerebral para determinar as coordenadas exatas usando o ponto bgma como referência. Neste estudo, o transplante de células-tronco é realizado em quatro locais distintos, utilizando as seguintes coordenadas estereotáxicas para marcar as posições no crânio; primeiramente, identifique o bgma.A seguir, zere as três coordenadas no controlador de exibição digital. Após zerar, utilize as coordenadas predeterminadas para localizar os sítios de transplante e faça uma marca com um marcador de ponta fina acoplado a um suporte de sonda na estrutura.Use uma broca para fazer furos de 0,35 milímetros através do crânio em cada local marcado. Tenha cuidado para evitar danos à membrana de Durham. Se houver sangramento durante a perfuração, aplique pressão firme usando um aplicador de algodão.O animal está agora pronto para o transplante. As células-tronco neurais humanas utilizadas para o transplante devem ser preparadas com antecedência e mantidas em gelo até o momento do uso. Quando estiver pronto, preencha uma seringa micro-precisão Hamilton de cinco microlitros com agulha 30 com a suspensão celular.Acople a seringa cheia a um pequeno suporte de sonda no estereotáxico. Uma vez posicionado corretamente, insira cuidadosamente a ponta da agulha no orifício no crânio até atingir a superfície do cérebro. Zere a coordenada DV no controlador com display digital e, em seguida, insira suavemente a agulha até a profundidade desejada.Mantenha a agulha no lugar por um minuto. Após esse tempo, injete as células a uma taxa de 0,25 microlitros por minuto, totalizando um microlitro. Mantenha a agulha no lugar por oito minutos antes de retrair, para prevenir o refluxo capilar do conteúdo injetado de volta pelo trajeto da agulha; retire lentamente a agulha do local de transplante a uma taxa de 0,5 milímetros por minuto.Repita este procedimento para os demais locais de transplante. Quando as injeções estiverem concluídas, remova o retrator de pele e use pinças rombas para puxar suavemente a pele de volta sobre o crânio. Feche a ferida com a aplicação de quatro a cinco clipes estéreis de aço inoxidável após a cirurgia.Coloque o animal em uma gaiola aquecida e monitore sua recuperação. Um mês após o transplante, amostras cerebrais foram seccionadas e coradas com BRDU para detectar as NSCs transplantadas e contra-coloradas com hematina. A trajetória da agulha, representada aqui pela linha vermelha, indica o percurso da injeção que depositou as NSCs no local de liberação do transplante designado como TR, conforme observado.Aqui, as Células-Tronco Neurais transplantadas mostraram extensa migração das regiões do corpo caloso e CA1 para o giro denteado e as regiões CA3 do hipocampo. É importante que o conjunto de imagens de RM adquirido seja usado com precisão em correspondência com um conjunto de imagens de TC. A fusão adequada das imagens é essencial para a identificação e delimitação subsequente das regiões do hipocampo antes do procedimento de tratamento; adquira imagens ortogonais de raios X para garantir o posicionamento preciso do animal. Para assegurar o sucesso do transplante, mantenha um ambiente cirúrgico estéril em todos os momentos.Marque as coordenadas de Otax com precisão e remova a microseringa após a injeção gradualmente para prevenir refluxo de fluido. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar um procedimento de radiação clinicamente relevante utilizando um modelo animal de sua escolha e de como transplantar cirurgicamente células-tronco para uma região específica do cérebro.

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