Geração de neurônios e células gliais a partir de corpos embrióides derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos

Pegue corpos embrióides, ou EBs, derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos. Esses EBs são compostos por três camadas germinativas.

Transferir os EB para uma placa de cultura revestida com matriz contendo um meio adequado e incubar.

A matriz permite que os EBs se prendam à placa de cultura.

Os fatores de crescimento e nutrientes no meio facilitam as células ectodérmicas dos EBs a formar agregados neuroepiteliais dispostos em um padrão circular denominado roseta.

Corte os fragmentos de roseta e retire-os do prato.

Colete os fragmentos e gire-os para baixo.

Rejeitar o sobrenadante e ressuspender os fragmentos.

Usando uma pipeta, mova os fragmentos para cima e para baixo para dissociá-los.

Adicione o número desejado de células a uma placa de poço revestida com matriz contendo um meio de diferenciação.

Os componentes do meio de diferenciação facilitam que as células neuroepiteliais se transformem em células neuronais e gliais totalmente funcionais, as células primárias do sistema nervoso.

No segundo dia, aspire a solução de revestimento de matriz padrão de uma placa de 60 mililitros previamente preparada e adicione 5 mililitros de meio de indução neuroepitelial completo ou NRI à placa. Trabalhando sob o microscópio estereoscópico com ampliação de 4x e usando uma pipeta de 200 microlitros, colete cerca de 50 corpos embrióides flutuantes e transfira para um prato revestido. Em seguida, incube o prato a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.

No dia seguinte, terceiro dia do procedimento de diferenciação, verifique o prato ao microscópio com ampliação de 10x para garantir que os corpos embrióides estejam todos presos. Em seguida, execute suavemente uma mudança total do meio com o meio NRI completo. Troque o meio NRI a cada dois dias até o sétimo dia, quando os agregados neuroepiteliais semelhantes a rosetas devem estar visíveis.

No sétimo dia, cubra uma placa de 96 poços pipetando 100 microlitros de matriz padrão diluída em meio de cultura em cada poço. No oitavo dia, corte os agregados em forma de roseta em fragmentos sob um microscópio estereoscópico com ampliação de 10x em condições estéreis.

Observe que as rosetas tendem a se soltar facilmente do prato quando tocadas com a agulha. Nesse caso, desagregue parcialmente a roseta destacada com a ponta da agulha. Se as rosetas permanecerem parcialmente presas, use uma pipeta de 200 microlitros para completar o descolamento dos fragmentos da roseta.

As estacas de roseta requerem boas habilidades manuais e precisão para evitar o corte de derivados não neuroectodérmicos.

Em seguida, colete os fragmentos de roseta e seu meio em um tubo cônico de 15 mililitros. Lave o prato com 2 mililitros de meio NRI para recuperar todos os fragmentos. Em seguida, gire os fragmentos de roseta a 112 vezes g por um ou dois minutos.

Depois de aspirar o sobrenadante, ressuspenda suavemente o pellet em 1 mililitro de 1x DPBS pré-aquecido sem cálcio e magnésio. Pipete suavemente os fragmentos de roseta para cima e para baixo para dissociá-los parcialmente. Em seguida, adicione 4 mililitros de meio NRI completo e conte as células usando azul de tripano e um contador de células automatizado.

Em seguida, aspire a solução de revestimento de matriz padrão da placa de 96 poços e deposite as células nos poços a uma densidade de cerca de 15.000 células por centímetro quadrado em meio NRI. Incube a placa durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. No dia 10, execute uma mudança total do meio usando o meio de diferenciação neuronal completo.