Isolando e Cultivando Células de Glioma Pontino Intrínseco Difuso

Comece com fragmentos de tecido do tronco cerebral contendo glioma pontino intrínseco difuso, um tumor derivado de células progenitoras gliais em um ambiente rico em nervos mielinizados.

Trate com enzimas proteolíticas para degradar a matriz extracelular do tecido.

Após a incubação, pipetar repetidamente o conteúdo para facilitar a dissociação celular e a degradação da bainha de mielina.

Filtrar e centrifugar para recolher as células. Remova o sobrenadante e ressuspenda-o em um tampão frio.

Adicione uma solução de sacarose para separação do gradiente de densidade e misture bem.

Em seguida, centrifugue para separar as células mais pesadas dos detritos de mielina mais leves.

Remova a camada de mielina e adicione um tampão de lise de hemácias.

Adicione um tampão frio para interromper a ação de lise. Centrifugue e remova o sobrenadante para eliminar as hemácias lisadas.

Ressuspender as células num meio neurobasal quente e cultivá-las num balão não revestido.

A ausência de fatores neurotrópicos causa a morte neuronal, enquanto as células progenitoras gliais utilizam nutrientes e fatores de crescimento, levando à proliferação. Adicione meio fresco para manter os níveis de fator de crescimento.

Com o tempo, essas células se agregam espontaneamente em aglomerados de células, formando neuroesferas flutuantes.

Neste procedimento, centrifugue o tubo cónico que contém os fragmentos de tecido remanescentes durante cinco minutos. Depois disso, remova o sobrenadante e adicione a solução de digestão enzimática pré-aquecida de forma que haja 5 mililitros de solução de digestão para cada 1 mililitro de tecido. Em seguida, sele a tampa do tubo cônico com filme de laboratório e incube a reação em um rotador a 37 graus Celsius por 30 minutos.

Após a incubação, triturar as amostras suavemente. Usando uma pipeta sorológica de 10 mililitros, pipetar a amostra para cima e para baixo por 6 a 8 vezes e evitar gerar bolhas de ar excessivas. Em seguida, adicione uma ponta de pipeta de 1000 microlitros ao final da pipeta e triture a amostra por mais 6 a 8 vezes.

Deixe que os pedaços restantes se depositem no fundo do tubo. Em seguida, remova e filtre o sobrenadante com a célula ainda suspensa através de um filtro de 100 mícrons em um novo tubo cônico de 50 mililitros rotulado dissociação enzimática e armazene-o no gelo. Em seguida, centrifugar o tubo de dissociação enzimática durante cinco minutos e continuar a centrifugação com gradiente de sacarose. Se a amostra ainda estiver suspensa em solução, centrifugue-a durante cinco minutos.

Em seguida, remova o sobrenadante e ressuspenda o tecido em 20 mililitros de HBSS frio sem cálcio e magnésio. Em seguida, aumente o volume para 25 mililitros com HBSS frio. Lentamente, adicione 25 mililitros de solução de sacarose 1,8 molar e inverta o tubo para misturar. Isso resulta em um gradiente de sacarose molar de 0,9.

Em seguida, centrifugue a amostra sem interrupção por 10 minutos. Aspire cuidadosamente os detritos de mielina e o máximo de solução de sacarose possível. Em seguida, lave a amostra adicionando 30 mililitros de HBSS frio sem cálcio e magnésio e misturando delicadamente. Depois disso, centrifugue por cinco minutos.

Neste procedimento, remova o sobrenadante de lavagem. Adicione 5 mililitros de tampão de lise ACK e ressuspenda suavemente o pellet celular, girando o tubo por um minuto em temperatura ambiente. Em seguida, sacie a lise adicionando 30 mililitros de HBSS frio sem cálcio e magnésio.

Em seguida, centrifugue por cinco minutos. Ressuspenda o pellet celular final em 10 a 15 mililitros de TSM completo quente com fatores de crescimento e quantifique a densidade celular viável em um hemocitômetro usando a exclusão de azul de tripano. Em seguida, transferir a suspensão final das células para um novo balão de cultura T75. Adicione fatores de crescimento adicionais a cada dois dias para manter os níveis gerais de fator de crescimento e monitorar o desenvolvimento de neuroesferas de células tumorais.