Microfabricated Pós-Array-detectores (mPADs): uma abordagem para isolar Forças Mecânica

Olá, sou Nathan Snia Decky e comigo hoje está Wes Ligan, Robbie Desai e Mike Yang. E nós somos do laboratório de Chris Chen aqui na Universidade da Pensilvânia. Neste vídeo, apresentaremos nossa abordagem para medir as forças de atração celular usando uma matriz microfabricada de postes.

As forças de tração são geradas por meio de interações de miosina e actons e desempenham um papel importante em nossa fisiologia. Durante o desenvolvimento, eles permitem que as células se movam de um local para outro para formar as primeiras estruturas do nosso tecido. E também ajudam no processo de cicatrização, pois são necessários para o fechamento de feridas ou a migração e rastejamento de leucócitos pelo nosso corpo.

Mas, infelizmente, essas mesmas forças podem ser prejudiciais à nossa saúde no caso de metástase de câncer ou crescimento vascular em direção a um tumor. Portanto, existem muito poucos métodos pelos quais se pode realmente medir essas forças de tração de maneira quantitativa e, especialmente, na micro e nanoescala de células individuais. A maioria dos métodos comuns para estudar células in vitro tem sido com placas de fundo de vidro ou placas de poliestireno, mas esses são substratos muito rígidos e não são, eles não nos permitem medir fisicamente as forças de tração e as difamações que uma célula causa.

E por isso tem sido muito difícil entender os mecanismos subjacentes das forças de tração sem algum tipo de leitura física. E assim, no laboratório de Chris Chen, temos uma técnica que nos permite superar essas limitações. Nosso método é baseado em uma matriz vertical de cantilevers flexíveis, cuja rigidez e escala de tamanho são tais que as células individuais se espalham por vários balanços e os desviam no processo.

As dimensões que usamos com mais frequência são três mícrons de diâmetro, postes cilíndricos de diâmetro, 10 mícrons de altura com um espaçamento de centro a centro de nove mícrons e uma matriz retangular. No entanto, essas dimensões podem ser variadas para acomodar uma variedade de estudos celulares. Começamos com um mestre de silício rígido que você pode ver aqui e depois os traduzimos em balanços PDMS flexíveis que vemos aqui.

Usando essa técnica, podemos medir as deflexões de balanços individuais sob um microscópio e retirar as forças de tração celular com a magnitude e a direção necessárias para gerar tais deflexões. Transformamos esses substratos em almofadas M para detectores de micro pós-array e, neste vídeo, mostraremos como fabricar as almofadas M, começando com o mestre de silicone através da replicação do PDMS e, finalmente, para o cálculo da modulação e contratilidade celular. Olá, aqui estamos nós na sala limpa de nossos laboratórios.

Esta é uma sala livre de poeira e sensível à luz que nos permite fazer o SU oito postes que servirão como mestre do silício. Primeiro começaremos com um wafer de silício e, com isso, vamos revesti-lo com SU oito fotorresistentes, SU oito é uma resistência negativa e é sensível à luz. Então, quando iluminamos através dessa máscara fotográfica, ela fará com que a luz padronize os micropostes e, em seguida, forme uma estrutura tridimensional, que serão os oito postes SU que lançamos no PDMS.

Então, depois de fazermos todo o nosso processamento, o wafer ficará assim, que é onde temos o micro pilar, as micro estruturas de postes já fabricadas no wafer. Então, para fazer os mestres, primeiro começamos com um wafer de silício nu e isso foi limpo com tratamento com ozônio por sete minutos e também desidratamos esse wafer por 30 minutos a 120 graus Celsius. Vamos girar SU oito 2002 nisso para formar uma camada de base muito fina para as postagens.

Então, como vamos girar SU oito, vou usar uma máscara de gás, recarregar o wafer neste suporte aqui, tirar o pó de qualquer poeira que possa estar lá, colocá-lo no spinner, vamos verificar se está centralizado E então continuaremos a derramar o SU oito 2002 em cima disso. E então vamos girar o wafer. Em seguida, colocamos na chapa quente, o cozimento macio.

Fazemos isso por um minuto depois. Em seguida, pegamos e transferimos para a placa quente de 95 graus. E fazemos isso por dois minutos.

E quando terminar, vamos pegar isso agora e sair para fazer a exposição à inundação no alinhador de máscara. Ok, então acabamos de girar SU oito, a primeira camada de SU oito neste wafer, e agora precisamos expor todo o wafer para criar essa primeira camada de base para os micropostes. Então, precisamos dar a isso 70 milijoules de exposição.

Então, precisamos medir a intensidade real da luz em nosso alinhador de máscara aqui. Então, carregamos o medidor no peso do alinhador de máscara. Em seguida, o expomos com luz.

Esta é a luz ultravioleta aqui. Carregamos o wafer de silício no alinhador de máscara, colocamos no alinhador de máscara. E não temos uma máscara desta vez, para que possamos expor o filme inteiro.

Vamos acender o obturador e vamos discar um minuto de exposição e vamos expor. Então, depois de um minuto, o sistema está pronto, podemos retirar o wafer. E agora precisamos fazer o cozimento pós-exposição.

Então, acabamos de expor esse wafer e agora vamos adicionar calor para causar a reação de reticulação para este primeiro revestimento de SU oito. Então, colocamos em uma placa quente de 65 graus por um minuto e depois transferimos para uma placa quente de 95 graus por dois minutos. Após o processo de dois minutos, desligamos a placa quente e deixamos o wafer esfriar de volta à temperatura ambiente, o que leva cerca de 30 minutos.

Então, giramos nossa segunda camada de SU oito neste wafer. E agora precisamos realmente expor isso por meio da máscara fotográfica. Desta vez, vamos usar um filtro UV para bloquear essa luz UV profunda.

Este é um vidro óptico Hoya que você pode obter, mas desta vez precisamos medir novamente a intensidade. Então, vamos usar nosso medidor de luz ou vamos usar o filtro na parte superior para medir a intensidade que foi filtrada. E então vamos carregar a máscara no alinhador de máscara.

Este interruptor cria vácuo que mantém a máscara no lugar. Em seguida, vamos colocá-lo no alinhador de máscara. Em seguida, colocaremos o filtro em cima e carregaremos nosso wafer.

Queremos ter certeza de que há um bom contato, então o colocamos em contato e, em seguida, iniciaremos a exposição Após a exposição, tiraremos nosso wafer do alinhador da máscara. Portanto, agora temos áreas que foram expostas seletivamente. Vamos levar isso ao forno, às chapas quentes para assar pós-exposição.

Então, acabamos de fazer o po, o cozimento final pós-exposição, e agora vamos desenvolver esse wafer para que possamos realmente obter as estruturas tridimensionais. O que vamos fazer é lavar isso, desenvolver isso em P-G-M-E-A, que lavará o SU oito não exposto. Então, começamos primeiro em um prato de PGA e colocamos a bolacha aqui por dois minutos com agitação leve.

Então, vou deixar isso passar por dois minutos. Então, vamos transferir para um segundo prato de P-G-M-E-A. Isso removerá aquele PGA saturado com SU oito.

Após 10 segundos, vamos trazê-lo para o IPA. Isso lava o P-G-M-E-A. Colocamos aqui por 20 segundos, novamente com uma leve agitação.

E então, agora, temos as estruturas de postes independentes. Então, vamos colocar isso em hexano, que tem uma baixa tensão superficial. Vamos lavar por cinco segundos em um e depois dois hexanos, e então estamos prontos para secá-lo.

Então, acabamos de desenvolver o wafer e agora vamos colocá-lo em uma placa quente e aumentar lentamente a temperatura até um 50. E o que acontece é que essa temperatura mais alta liga ainda mais o SU oito para torná-lo mais rígido estruturalmente e o deixamos nesta placa quente durante a noite. Então, em qualquer lugar de 14 a 20 horas e depois, desligaremos a placa quente e deixaremos esfriar novamente à temperatura ambiente.

Então, o que precisamos fazer é cortar esse wafer em um tamanho menor. Basicamente, queremos cortar esse wafer de silício e criar um pequeno chip apenas com esse padrão interno aqui. E vai se parecer com essa estrutura lá, onde eles vão usar epóxi.

E vamos colar esse chip em uma lâmina de vidro assim. E isso fornece um suporte estrutural. Então, cortar um wafer em cubos, é uma espécie de arte, mas o que você pode fazer é basicamente usar um escriba de diamante e começar em apenas uma borda.

E por causa dos planos de cristal, você acabou de colocar um pequeno entalhe Agora que criou uma fratura, que eu posso tocar com essa ferramenta, podemos descascar isso e fazer mais cortes aqui até obtermos uma pequena estrutura como essa. E então você rapidamente coloca o chip de silício agora no vidro e o monta no lugar. E você deixa isso definir.

E então, depois de terminar, você terá um, você terá um dispositivo semelhante a este. Então, montamos o mestre de silício nessa lâmina de vidro e agora vamos dar a ele uma camada de floy, o que ajudará a liberar essa estrutura do PDMS mais tarde. Então, vamos colocar o chip nesse dessecador e, em seguida, vamos pegar algumas gotas desse tri Chloro Siling e colocar algumas gotas no dessecado.

Fazemos isso dentro do capô porque isso tem um subproduto do gás clorídrico hidrocrídrico, que é bastante duro. Vá em frente e feche a tampa, prenda-a ao vácuo e depois vamos em frente e deixemos isso descansar do vácuo e deixamos esse depósito durante a noite para obter um bom revestimento sobre todo o wafer de silício. Olá, sou Wesley Ligan.

Sou estudante de pós-graduação no laboratório de Christopher Chen. Neste ponto, Nate mostrou como criar um mestre de silicone para nossos substratos ED. No entanto, antes que possamos usar esta ferramenta para medir a contratilidade celular é necessário primeiro replicar as estruturas fotográficas rígidas usando um polímero de silicone elastomérico.

Nossa primeira tarefa é gerar um modelo negativo do mestre de silicone que fabricamos anteriormente. Fazemos isso usando um elastômero de silício chamado PDMS ou Polymethyl Sloane em nosso polímero PDMS. Agora adicionamos uma proporção de um para 10 de agente de cura.

Depois de pesar a solução, é necessário misturar bem o polímero PDMS e o agente de vazamento cruzado. Essa mistura obviamente introduz muitas bolhas de ar em nossa solução. Então, neste ponto, é necessário descobri-lo e desgaseificá-lo no dessecamento a vácuo.

Uma vez que o PDMS esteja totalmente desgaseificiado e todas as bolhas tenham subido à superfície e estourado, podemos removê-lo do dessecamento a vácuo. Agora podemos usar essa mistura de PDMS e agente de reticulação para gerar um molde negativo de nosso mestre de silício. E para fazer isso, usamos uma forma de torta e colocamos nosso mestre de silício montado no centro dela.

Em seguida, despejamos cuidadosamente a solução de polímero DGAs no prato por cima do wafer de silício, tentando evitar a formação de bolhas adicionais. Normalmente, tentamos derramar o polímero com aproximadamente um quarto de polegada de espessura. Você pode ver que esse processo inevitavelmente introduz algumas bolhas de ar na mistura.

Então, agora deixamos este prato de lado por aproximadamente 30 minutos para permitir que as bolhas subam à superfície e estourem. Podemos ver que depois de deixá-lo descansar, ainda existem algumas bolhas de ar na superfície do PDMS. No entanto, como eles estão na superfície superior, agora podemos usar uma explosão rápida de nitrogênio para estourar as bolhas restantes.

Para reticular totalmente a solução PDMS e CROSSLINKER e gerar um modelo negativo rígido de nosso mestre de silício, nós o assamos a 110 graus Celsius por 20 minutos. Podemos ver que há uma fina camada de PDMS no topo do substrato de silicone. E antes de podermos separar os dois, é necessário primeiro cortar essa camada.

Em seguida, podemos enxertar essa camada superior e retirá-la suavemente do substrato de silício. Neste ponto, podemos inverter e descascar muito lentamente o substrato de silício negativo, o substrato PDMS negativo do mestre de silicone. Ok, fazemos isso segurando uma extremidade para baixo e descascando suavemente o substrato PDMS.

Você pode ver o avanço frontal à medida que o substrato se desprende do mestre de silicone. Agora que geramos o molde negativo A-P-D-M-S do nosso mestre de silicone, podemos cortá-lo em quatro moldes negativos individuais para fazer os substratos finais da almofada. É importante, neste ponto, não tocar na parte superior do substrato negativo com uma pinça ou luvas para evitar danificar a superfície.

Então, neste ponto, geramos quatro modelos negativos individuais do mestre de silicone que consistem em poços de três mícrons de diâmetro e nove mícrons de profundidade. Para regenerar as superfícies cantilever elevadas, podemos fundir novamente nesses moldes negativos de um PDI PDMS utilizando o PDMS. No entanto, antes de fazermos isso, é necessário primeiro tornar esses moldes negativos não adesivos, revestindo com um fluoros.

Fazemos isso em uma câmara de plasma de cem watts com potência total por um minuto. Depois de permitir que a câmara bombeie o retorno do plasma, isso gera um campo de gás iônico que grava a superfície superior do PDMS e a torna mais adesiva às moléculas de flúor Cy Lane. Depois de remover os moldes negativos do dessecador a vácuo, você pode ver aqui que o que resta é uma matriz de poços profundos de três mícrons por 10 mícrons em uma camada PDMS não adesiva.

Para regenerar os cantiléveres verticais, que usamos para os substratos mpad, é necessário lançar novamente usando nossa mesma mistura PDMS e isso nos deixará com uma matriz independente positiva de cantiléveres elastoméricos, que espelham de forma idêntica o mestre de silício que fabricamos anteriormente. O primeiro passo neste procedimento é transferir nossos moldes negativos não adesivos para um gabarito de montagem que fizemos com tiras de PDMS e uma lâmina de microscópio de vidro. A razão para este equipamento ficará clara na próxima etapa.

Neste ponto, podemos depositar uma pequena gota de nossa mesma mistura de 10 para um de PDMS para reticulador já desgaseificador na superfície superior de cada um de nossos moldes negativos. Apenas uma pequena quantidade de PDMS é necessária para que não escorra para a borda dos moldes negativos. Neste ponto.

Para espalhar mais completamente o PDMS pela superfície superior dos moldes, podemos pegar um usando uma pinça, invertê-lo e colocá-lo em contato com o molde adjacente, espalhando-se cuidadosamente ao redor do PDMS para cobrir totalmente todo o substrato. Tenha muito cuidado nesta etapa para não introduzir mais bolhas na solução PDMS superior pode então repetir com os outros dois poços, outros dois moldes. Agora que temos um revestimento PDMS mais uniforme na superfície superior, podemos colocar este gabarito em um dessecador a vácuo para remover ainda mais quaisquer bolhas que possam estar presas no filme PDMS em cima de nossos moldes negativos.

Esse processo normalmente leva cerca de 30 minutos. Enquanto nossos moldes negativos estão desgaseificando, podemos limpar os substratos de vidro de 22 por 22 milímetros, que se tornarão o local de montagem final das almofadas. O primeiro passo neste processo é soprar quaisquer partículas de poeira usando nitrogênio comprimido.

Vamos expor as lamínulas de vidro ao plasma gasoso, que irá acinzentar a superfície e torná-la mais adesiva ao PMS, que vamos colar na próxima etapa. Depois de permitir que a camada superior do PDMS seja DGAs por aproximadamente 30 minutos e o plasma ative as lamínulas de vidro, podemos remover nosso gabarito e colocar a superfície superior das lamínulas de vidro, que foi exposta ao plasma de gás, em contato com a camada de PDMS em cima dos moldes negativos. Normalmente, ajuda colocar uma borda da lamínula de vidro em contato com o PDMS primeiro e, em seguida, permitir que o restante da lamínula de vidro se acomode em um SH para que o PDMS se espalhe em forma de folha.

Isso ajuda a reduzir quaisquer bolhas introduzidas no filme PDMS. Neste ponto, podemos pressionar suavemente a superfície superior da lamínula de vidro com nossa pinça para empurrar qualquer excesso de PDMS, bem como empurrar a lamínula contra a cruz PDMS no centro do gabarito. Isso evitará que a lamínula se mova enquanto o PDMS estiver curando.

Repetimos isso para os outros substratos. Neste ponto, podemos transferir todo o modelo para o forno e assar a 110 graus Celsius por 22 horas. Depois de permitir que todo o conjunto esfrie até a temperatura ambiente, podemos remover nossos substratos, invertê-los e retirar cuidadosamente o molde negativo da lamínula de vidro.

É importante fazer isso lenta e uniformemente para evitar esmagar os postes ou rasgá-los do substrato de vidro. Podemos ver que, depois de descascar o molde negativo, ficamos com uma série de cantilevers que imitam precisamente o Silicon Master, só que agora eles estão, eles são construídos a partir de um elastômero PDMS flexível. Ok, então, neste ponto, orientamos você sobre como geramos o Silicon Master de nossos substratos Emad.

Em seguida, usamos um processo de moldagem de réplica para gerar uma réplica exata usando polímero elastomérico APDS para que os cantilevers agora sejam flexíveis para permitir que a célula se espalhe, contraia e desvie os cantilevers no processo. Neste ponto, nossos substratos estão prontos para processamento para cultura de células. Agora que vimos como fabricar e replicar moldes para fazer os EDS, vamos fazer mais algumas etapas para tornar o EDS funcional para que possamos nos cultivar e, posteriormente, analisar as forças de tração.

Mas antes de fazermos isso, precisamos fazer três coisas. Precisamos tornar as pontas dos postes adesivas às células. Em segundo lugar, precisamos rotular fluorescentemente o PDMS para ajudar na visualização e análise das deflexões do poste.

E em terceiro lugar, precisamos tornar as paredes laterais dos postes, bem como a base dos postes, não adesivas às células, de modo que as forças de tração sejam exercidas apenas nas pontas dos postes. Então, veremos como essas etapas procedem por meio da estratégia baseada em impressão de micro contato nos minutos subsequentes. Mas primeiro, o próximo passo é limpar o excesso de P-D-S-P-D-M-S dos eds.

Então, como mencionei, o primeiro passo é pegar o substrato EDS, que West acabou de mostrar como gerá-lo e apará-lo. O excesso de PDMS resultante da cura da lamínula de vidro contra o molde negativo e do uso de uma guarnição afiada da lâmina de barbear. O excesso de PDMS, você faz isso, colocando a lâmina de barbear verticalmente para baixo no substrato na borda dos pilares e, em seguida, raspando.

E você pode usar um dedo para segurar a lamínula no lugar para que a lamínula não se mova. Então, o que acabamos com é um substrato de almofada M que foi limpo de detritos e, portanto, é facilmente acessível. Então, para a próxima etapa, temos que micro contato, imprimir os MPAs para tornar as pontas dos postes adesivas.

Para fazer isso, primeiro precisamos gerar carimbos, e esse processo é muito fácil. Simplesmente misturamos o PDMS em vez de uma proporção de 10 para um, uma proporção de um para 30 para um. Despejamos em uma placa de Petri de forma que a altura do PDMS seja de aproximadamente um centímetro.

Deixe desgaseificar. Ou seja, deixe as bolhas subirem até o topo do PDMS e cure a reação de reticulação no forno a 60 graus por uma hora depois de retirar o prato do forno e deixá-lo esfriar, agora estou pronto para cortar os selos. Então, novamente, com o mesmo tipo de lâmina de barbear, simplesmente corte pressionando verticalmente para baixo no PDMS até fazer contato com o fundo da placa de Petri.

Agora, a orientação do carimbo é algo que queremos prestar atenção. A superfície do carimbo será o lado do PDMS que foi fundido contra o fundo da placa de Petri para que permaneça plana. Então, neste grande quadrado de PDMS que eu cortei, a superfície do carimbo agora está voltada para cima.

Agora, esse carimbo é muito maior do que as almofadas M, então vou reduzi-lo ao tamanho de uma única almofada M novamente cortando com a lâmina de barbear, porque é muito difícil dizer a orientação correta do carimbo a olho nu, vou colocar um pequeno entalhe no que será a parte de trás do carimbo que é o lado sem face assim. E posso então remover o carimbo da laje maior. E agora tenho o selo A-P-D-M-S para o próximo passo.

Queremos limpar os carimbos do PDMS. Uma vez que é muito possível que a poeira da atmosfera tenha se depositado nos selos PDMS enquanto eu os cortava. Este é um processo no qual colocamos o número desejado de selos PDMS neste prato de cristalização e enchemos o prato de cristalização com 100% de etanol.

Portanto, basta adicionar etanol suficiente para cobrir a face dos selos, mas a quantidade exata de etanol adicionada não é importante. Em seguida, coloque o disco de cristalização em um ator e sonice os selos por cinco minutos. Após os cinco minutos, terminaremos de esterilizar os carimbos e faremos o restante da impressão de micro contato que é a funcionalização das almofadas M em uma capa de cultura de tecidos estéril.

Então, agora estamos na capa de cultura de tecidos, onde podemos terminar de esterilizar os carimbos. Para fazer isso, pegamos os selos do prato de cristalização, mergulhamo-los em um prato cheio de etanol para enxaguar quaisquer detritos restantes e, finalmente, mergulhamo-los em um prato com água para enxaguar o etanol. Em seguida, com um jato de nitrogênio, secamos os selos até que não haja mais gotas visíveis.

Então, o próximo passo, temos que pintar os selos com uma solução de proteína. A solução de proteína que estamos usando é de 50 microgramas por mil de fibrina na água DEI. Basta pegar um pouco da solução de proteína na pipeta e colocar gotas da solução de proteína na face do carimbo.

Você deseja fazer isso colocando pequenas gotículas na borda da face do carimbo. Primeiro, repita isso para todos os carimbos que você usará e eu deveria ter feito isso com antecedência. Então, o próximo passo depois de colocar pontos nas bordas de todos os selos é conectar essas gotículas e preencher a solução de proteína na face do carimbo.

A razão pela qual fizemos isso é porque a solução de proteína nas gotículas e sos embaixo das gotículas torna a superfície do carimbo hidrofílica, facilitando a disseminação da proteína da matriz extracelular. Então, novamente, repita isso para todos os carimbos que você está usando agora que espalhamos a solução de proteína na face dos selos, a última etapa para pintar os carimbos é garantir que as bordas estejam cobertas. Para fazer isso, simplesmente inclinamos uma pipeta e a passamos ao longo da face do carimbo para que você entre em contato com o canto do carimbo PDMS e a solução de proteína.

E, novamente, repita isso para todas as bordas de todos os carimbos que você está pintando. Agora que terminamos de pintar os carimbos, colocamos esses carimbos, deixamos os carimbos na capa de cultura de tecidos por uma hora para facilitar a absorção completa da proteína na face do selo. Então, agora que esperamos uma hora para que as proteínas sejam armazenadas, absorvidas na superfície do carimbo, agora é hora de enxaguá-las com água e secá-las com nitrogênio.

Para fazer isso, pegamos água estéril e despejamos a água estéril no prato que contém os selos. Cuidado para não derramar a água diretamente na face do carimbo e você pode usar uma pipeta, se necessário. A quantidade exata de água que você ingeriu não é importante, desde que você coloque o nível da água acima da solução proteica.

Depois disso, com uma pinça estéril, pegue um carimbo, mergulhe-o em um novo prato com água e seque-o suavemente com nitrogênio. Novamente, você saberá que está seco quando vir, quando não vir mais gotículas de solução de proteína no selo. E repita isso para todos os carimbos que você está processando um de cada vez.

Agora que enxaguamos os carimbos, é hora de ativar os substratos do mpad tratando-os com ozônio UV. Por sete minutos, retiro a tampa da placa de Petri de cima, de cima da placa. Porque você, porque o poliestireno é absorvente de UV, coloco o prato no tratador de ozônio UV, fecho a gaveta, ajusto o tempo para sete minutos e deixo ir.

Então, agora estamos de volta ao capô de cultura de tecidos e é hora de carimbar os substratos mpad, que foram tratados apenas com ozônio UV. Para fazer isso, levante nossos carimbos enxaguados e secos com uma pinça. Você pode manusear os carimbos pelos lados, mas não toque na face do carimbo.

Você deseja ajustar o carimbo na pinça para que o lado da proteína fique acessível. Em seguida, inverta a pinça, tendo em mente que o lado da proteína é baseado para baixo e lentamente coloca o carimbo em contato com os eds. Os selos de um a 30 são bem pegajosos, então você pode ter que usar um segundo par de pinças para liberar o carimbo da pinça.

Você pode soltar o selo de uma altura de cerca de dois milímetros para cerca de oito milímetros nos emeds. Em seguida, incline o prato dos emeds para cima e pressione suavemente com uma pinça para criar contato entre o carimbo e os eds. Você saberá quando o contato for feito de duas maneiras.

A primeira é olhar para a superfície do ED através do lado do selo. Isso pode ser difícil de ver na câmera, mas a olho nu posso ver claramente que o carimbo está fazendo contato com a superfície olhando para a superfície através da lateral do selo. A segunda maneira de garantir o contato com o p é tirar a placa de Petri da capa de cultura de tecidos com a tampa e visualizá-la sob um microscópio invertido.

Ao visualizar os padrões de interferência com o microscópio, você deve ser capaz de dizer quando, se e quando o carimbo está em contato com os eds. Depois de determinar o contato, o carimbo só precisa permanecer em contato com este, com o substrato ed por alguns segundos. Portanto, agora é hora de remover o selo.

Para fazer isso, dobre Eds para baixo com um par de pinças e, em um movimento suave, retire o carimbo. Certifique-se de acompanhar quais eds você carimbou e quais carimbos você já usou. E repita este procedimento uma vez por EMPAs para cada substrato que você deseja usar.

Agora que carimbamos os EMPAs, o próximo passo é esterilizá-los e depois incubá-los em um corante lipofílico chamado olho de corante. Dai é uma molécula lipofílica que é marcada com fluorescência, por isso se difunde no PDMS ao longo do tempo, o que nos permite visualizar as deflexões pós ao microscópio. Então, o que vou fazer é pegar cada substrato de empa individual, um de cada vez, e mergulhá-lo em 100% de etanol, 70% de etanol DI de água DI de água DI de água DI.

E, finalmente, uma solução de cinco microgramas por mil de dii. A solução DII é fluorescente, portanto, para minimizar sua exposição à luz ambiente e minimizar seu fotobranqueamento, cobrimos os pratos com papel alumínio enquanto eles incubam na capa de cultura de tecidos por uma hora. Agora que esperamos uma hora para que as almofadas EM sejam incubadas na solução DAI, podemos remover a folha de alumínio e enxaguar a solução DAI.

Enxaguamos o fazendo três imersões sequenciais em água esterilizada e, finalmente, mergulhamos em uma solução de 0,2% de F1 27 onic. Isso é 0,2% de peso por volume Durante todas as etapas de imersão, é importante minimizar o tempo que as almofadas EM ficam expostas ao ar. Isso é para evitar danos aos substratos de ED e, especificamente, evitar que dois postes desmoronem um sobre o outro.

O F1 27 0,2% onic é um copolímero tribloco composto por domínios hidrofílicos e hidrofóbicos. O domínio hidrofílico é conhecido por resistir à absorção de proteínas e, portanto, à adesão celular, enquanto o domínio hidrofóbico se liga ao temperamento ao PDMS hidrofóbico. Assim, quando o PDMS é embebido em F1 27, o F1 27 se liga ao PDMS e repele a adesão celular.

Após uma hora de incubação em F1 27 crônico em uma placa de Petri coberta com papel alumínio, podemos enxaguar o F1 27 por imersões sequenciais em água estéril, água estéril e PBS. Após a imersão em PBS e o produto F1 27 ter sido enxaguado, podemos então imergir os substratos dos eds na solução de cultura de células de sua escolha. A solução de cultura de células em que acabei de imergir os EMPAs pode conter soro e/ou outros fatores de crescimento e/ou suplementos como penicilina e estreptomicina.

Todos esses ingredientes são totalmente compatíveis com os tratamentos EMPA. Agora, o próximo passo, uma vez que os eds tenham sido imersos na solução de cultura de células, é semear as células de escolha nos eds. Para esta configuração experimental em particular, semearei células endoteliais da aorta pulmonar bovina em três pratos diferentes.

A razão pela qual estou usando três pratos diferentes é porque tratarei dois dos pratos com inibidores de tato conhecidos para inibir as deflexões dos postes, como poderemos testar posteriormente. Então, para semear as células, eu simplesmente pego minha suspensão celular, coloco a quantidade apropriada na pipeta e pipeta gota a gota em cada prato. Eu adiciono células suficientes para que, quando eu fizer o ensaio para medir as forças de tração, as células existam como células unicelulares nos eds.

A quantidade que você adiciona dependerá da área de propagação, bem como da taxa de crescimento de suas células específicas. Normalmente semeamos entre 1500 e 5.000 células por centímetro quadrado de substrato. Depois de terminar de semear as células ou editar a suspensão celular, coloque a cultura suavemente para frente e para trás várias vezes em direções ortogonais para misturar a suspensão celular na placa de cultura.

Repita esse processo para todos os substratos que você estiver usando. Imediatamente após a semeadura das células, coloque-as em uma incubadora de 37 graus em um nível apropriado de dióxido de carbono para amortecer o pH e o meio de cultura celular. Duas horas, cerca de duas horas após a semeadura das células, é apropriado enxaguar as células transferindo os substratos de uma placa de meio para uma nova placa do mesmo meio de cultura de células.

A razão para esse enxágue é que a maioria das células terá começado a se espalhar e terá atingido quase sua área de propagação final em duas horas. Ao enxaguar a célula, os substratos, você está removendo todas as células flutuantes do meio de cultura celular. Dessa forma, apenas as células que se ligaram ao EDS e estão iniciando o processo de espalhamento aparecerão no ensaio final para forças de tração.

Um ensaio que podemos realizar com células que foram cultivadas em MPAs é a imagem de lapso de tempo para examinar quantitativamente a dinâmica da contratilidade celular. Em particular, que a dinâmica da contratilidade celular em resposta a fatores solúveis é interessante. Sabe-se que fatores solúveis, como compostos biológicos e compostos sintéticos, aumentam, diminuem ou têm efeitos desconhecidos na contratilidade celular.

Para este experimento de células vivas, usaremos este microscópio de epifluorescência invertido. No estágio do microscópio, tenho uma pequena caixa de incubadora conectada a um regulador térmico para manter a temperatura em 37 graus Celsius com 5% de CO2. Estaremos visualizando imagens em alta ampliação com uma objetiva APO de plano de 60 x.

Agora vamos preparar o substrato de impacto para imagens. A objetiva de 60 x que estamos usando para imagens tem uma distância de trabalho de 200 mícrons, que é muito mais fina do que a espessura da placa de cultura de tecidos na qual semeamos as células anteriormente. Portanto, não podemos, não podemos obter imagens de células nos implantes na placa de cultura de tecidos.

Para contornar esse problema, usamos esses pratos com fundo de vidro. Agora vou transferir o substrato para o prato de fundo de vidro de cabeça para baixo para que as células e as pontas dos postes fiquem na interface do prato de fundo de vidro. Portanto, quando isso é colocado no microscópio, a distância de trabalho entre as células e a objetiva é inferior a 200 mícrons.

Agora estamos prontos para colocar isso em um microscópio para imagens. Agora vou abrir a câmara da incubadora de células vivas, colocar a amostra dentro e recolocar a tampa da câmara da incubadora. Neste ponto, examinarei o substrato em busca de uma célula adequada.

Para a imagem. A maneira mais eficiente de fazer isso é usar uma objetiva de 10 x da fase um da face, o que me permitirá ver um campo mais amplo do substrato e encontrar uma célula mais rapidamente. Meu critério para uma boa célula é para uma única célula.

Não deve tocar em nenhuma célula vizinha, e também deve ter um tamanho médio em comparação com todas as outras células do substrato, encontrei uma célula adequada para olhar. A próxima coisa que farei é mudar a objetiva para 60 x para olhar para a célula em alta ampliação. Para fazer isso, desfocamos o objetivo, para que não bata no palco durante a rotação.

Durante a rotação da torre, abra a câmara, gire parcialmente a entrevista objetiva 60 x 60 x 60 x objetiva é uma lente de imersão em óleo, então temos que colocar uma gota de óleo de imersão na lente objetiva. Agora vamos terminar de girar o turt para colocar o 60 x na posição. Vamos fechar a câmara da incubadora e reorientar o objetivo para trazer a célula de volta ao foco.

Depois de ajustar a posição e o foco da célula, mudarei para a câmera CCD para visualizar a célula na tela do computador e, em seguida, iniciar a imagem com lapso de tempo. Para este experimento, estarei, coletarei imagens de fase e fluorescentes em um intervalo de um minuto, então a imagem de lapso de tempo começou e vou deixá-la rodar por 10 minutos ou 10 quadros, e que nesse ponto adicionarei soro 10 minutos já se passaram. Neste momento, vou abrir a câmara e adicionar soro ao prato para estimular a contratilidade na célula.

O cronômetro ainda está funcionando, então tenho que ser rápido ao fazer isso Agora, continuaremos a fazer imagens da célula por 30 minutos para acompanhar quaisquer alterações na contratilidade. Depois de terminarmos a imagem de lapso de tempo, as imagens podem ser sequenciadas em um filme exibido. Aqui estão dois filmes das imagens de fase e fluorescência.

À esquerda está um filme de fase de uma, de uma célula quase transparente delineada em preto. A célula está espalhada pelas pontas de 20 postes, que são as estruturas circulares dispostas em uma treliça retangular. À direita está um filme fluorescente da mesma célula, mas apenas os postes são visíveis.

Se eu reproduzir esses filmes, você verá que os postes presos à célula são inicialmente fracos, desviados e se desviam muito pouco da treliça retangular. No meio do filme, adicionei soro à mídia. O soro estimula a célula a aumentar a contratilidade.

À medida que a célula exerce maiores forças de tração nos postes subjacentes, os postes ao longo do perímetro da célula começam a se desviar para dentro. No filme fluorescente, agora você vê os postes se desviarem significativamente de suas posições na treliça retangular. Como descreveria mais tarde, o deslocamento dessas posições de poste nessas imagens pode ser usado para analisar as forças de tração dessa célula.

Anteriormente, vimos como geramos os substratos mpad e como os funcionalizamos para cultivar células. Agora você deve ter notado que coloquei os substratos mpad acabados em três pratos diferentes de cultura de células. As células têm crescido durante a noite, e agora o que vou fazer é tratar cada placa de cultura de células individual com um agente solúvel diferente que modula a contratilidade de uma maneira conhecida.

Podemos então medir de forma quantitativa as forças de tração que resultam Depois de fixar as células até 30 minutos. Depois de adicionar os fatores solúveis 30 minutos após a adição dos inibidores de contratilidade, agora é hora de fixar as células com aldeído paraforme para travar o estado atual das forças de tração. Para fazer isso, é importante usar aldeído paraforme contendo cálcio e magnésio, e usamos aldeído paraforme em uma porcentagem de volume de 3,7%O método de imersão dos substratos em aldeído paraforme, desculpe, é o mesmo que o método de imersão dos substratos neste, nos diferentes RINs durante a funcionalização.

Ou seja, é importante não deixar os substratos secarem, pois isso pode levar ao pós-colapso. Depois de transferir, transferi os substratos, deixei-os incubar no aldeído paraforme por 20 minutos. Após os 20 minutos, removemos os substratos do aldeído paraforme agora e agora que as células foram fixadas, podemos processar essas amostras para imunocoloração padrão.

Para fazer isso, colocamos os substratos voltados para cima no param e pipetamos em PBS suficiente para cobrir o substrato e mantê-lo embaixo do PBS. Em seguida, enxaguamos um substrato três vezes com PBS para remover qualquer aldeído paraforme que possa ser deixado na cultura. Depois de enxaguar o substrato três vezes com PBS, podemos transferir o substrato para imunocoloração a jusante.

Fazemos isso manuseando o substrato com uma pinça e invertendo na primeira etapa da imunocoloração, que é um agente de permeação. Nesse caso, estamos usando 0,2% Triton X em PBS. No entanto, o usuário pode usar qualquer agente de ização mais apropriado para suas necessidades.

Repetimos isso para todos os nossos substratos e é assim que lidamos com os substratos durante o processo de coloração imunológica. Após a coloração imunológica, os substratos são montados em uma lâmina de vidro padrão de uma polegada por três polegadas, que pode então ser processada em qualquer microscópio de epifluorescência, seja ele invertido ou vertical. Ao processar as amostras em um microscópio confocal, podemos nos concentrar na parte inferior dos postes para obter as posições não desviadas, ou seja, nulas.

Podemos então focar nas pontas dos postes, tirar outra imagem dos postes e, comparando a imagem superior com a inferior, podemos medir as deflexões dos postes e calcular as forças de tração das células que as células geraram para produzir tais deflexões. Ao fazer esse processo para muitas células diferentes em várias condições diferentes, podemos comparar as forças de tração geradas nas diferentes condições. Agora que coletamos imagens de células vivas e fixas, a próxima tarefa é medir a deflexão, medir as forças de tração nas células.

Para fazer isso, para fazer isso, escrevemos um programa de computador em matlab. Estas são as três imagens que usaremos nesta análise. A primeira imagem é uma imagem de fase da célula.

É útil para identificar a localização da célula. A segunda imagem é uma imagem fluorescente dos topos dos postes. Usamos esta imagem para localizar as posições dos postes em sua ponta.

Como você pode ver, alguns desses postes são desviados e se desviam da treliça retangular em que a maioria dos postes está localizada, como este post. E este post. A terceira imagem que usaremos é a imagem base, que captura a posição dos postes em um, no, em um plano focal que atravessa o, através de sua base.

Neste nível, os postes desviados e não desviados devem estar localizados em sua posição de repouso, posições não desviadas. Na treliça retangular, você pode ver que os postes que foram desviados na segunda imagem em sua base, eles estão em sua posição FL. Esta imagem é usada para encontrar a posição do post-it, ou seja, está sob a posição refletida.

Em seguida, carregamos o programa MATLAB, que nos solicitará o carregamento dessas três imagens. Dê um nome ao arquivo. Você vê a imagem da fase.

Vamos desenhar uma caixa ao redor do indicando onde está a célula, para que o programa saiba quais postagens analisar. O programa então executa em intensidade, limiar e ização da imagem recortada para determinar as coordenadas OID dos postes. À esquerda estão imagens izadas de postagens da imagem superior, enquanto à direita são imagens izadas das mesmas postagens da imagem base.

Depois de obter os postes, coordenadas OID, o programa pode então determinar os vetores de deslocamento entre a ponta e a base de cada poste. Esses vetores de deslocamento do poste podem ser convertidos em vetores de força multiplicando-os pela constante de mola do poste. Podemos analisar essas forças celulares de várias maneiras, como força média por célula ou força média por poste.

Um resultado útil é um gráfico de aljava a partir do qual podemos visualizar a distribuição espacial das forças. Esta é a célula que acabamos de analisar e você pode ver que sobrepus setas amarelas nos postes que se correlacionam com a magnitude da força e apontam na direção da força. Ao repetir esse processo de análise de imagem para imagens de sequências, como as que são necessárias em nosso filme de lapso de tempo, podemos gerar uma sequência temporal.

Aqui está um filme da célula que estimulamos com soro. Como você pode ver, assim como o soro foi adicionado, a célula aumentou a contratilidade e desviou ainda mais os postes. Além disso, podemos quantificar as forças para um número maior de células que foram submetidas a diferentes condições e, em seguida, fixadas coradas, como exemplificado por esses gráficos de aljava mostrando uma célula tratada com um composto de controle versus células tratadas com inibidores de contratilidade.

Como você pode. Como você pode ver, os vetores de força na célula no caso de controle são maiores do que os maiores em magnitude do que os vetores de força. Nos dois casos em que os inibidores de contratilidade foram usados, cobrimos muito material aqui para descrever o substrato do caminho desde a microfabricação até a preparação, experimentação e análise da amostra para demonstrar a versatilidade versátil desses substratos.

Descrevemos dois ensaios diferentes, imagens de células vivas e ensaios de amostra fixa, e fizemos análises de células obtidas de ambos os ensaios e mostramos gráficos de aljava e filmes de aljava. Com esta poderosa ferramenta, pode-se fazer uma variedade de análises espaciais e temporais da contratilidade celular. Como você viu, esse método se baseou em muitas disciplinas diferentes, incluindo as de microfabricação, biologia celular básica, ciência de superfície, análise e processamento de imagens e muitas outras.

E é justamente por seu método ser fundamentado em diversas técnicas de engenharia que parâmetros como pós-geometria, fatores solúveis induzidos e métodos de análise de pós-deflexões podem ser personalizados de acordo com a necessidade do usuário. Esperamos que a demonstração visual desse método que descrevemos nos últimos 20, 30 minutos possa ser usada como ponto de partida para outras análises mais profundas sobre a regulação, consequências funcionais e geração de forças de atração celular.