Transfectando e Nucleofecting células-tronco pluripotentes induzidas

O objetivo geral deste experimento é obter alta eficiência de transfeção em células-tronco pluripotentes induzidas humanas utilizando protocolos otimizados de transfeção e afetação nuclear. Isso é alcançado primeiramente estabelecendo culturas livres de células de suporte de células-tronco pluripotentes induzidas humanas. Para a transfeção, as células-tronco pluripotentes induzidas humanas são semeadas sobre gelatina, TRX ou matrigel durante a noite.

Enquanto para a transfeção nuclear, agregados pequenos de células são obtidos por tripsina, uma mistura de DNA plasmidial e reagente de transfeção GeneJuice é adicionada às células plaqueadas e, em seguida, a placa é centrifugada e incubada a 37 graus Celsius. A suspensão de células IPS humanas é transfectada nuclearmente em um dispositivo de transfeção nuclear, e as células são ressuspendidas em meio condicionado com metionina e incubadas a 37 graus Celsius. Em última análise, podem ser obtidos resultados que demonstram manipulação genética eficiente por meio de alta eficiência de transfeção em células IPS humanas.

A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como a eletroporação de transfeção e os métodos de afetação nuclear descritos anteriormente, é que uma alta eficiência de transfeção em células IPS humanas com resultados consistentes pode ser rotineiramente alcançada em nosso laboratório. Nossos protocolos também garantem uma morte celular mínima após a modificação genética. Assim, nossos protocolos permitem a geração rápida e em larga escala de linhagens de células IPS humanas transgênicas. Antes de adaptar as células-tronco pluripotentes induzidas humanas a culturas livres de camada de sustentação, prepare placas revestidas com gelt TRX.

Em seguida, massageie as CIPs humanas previamente mantidas em células de alimentação com um mililitro de acitretina por poço e incube a 37 graus Celsius por um minuto, até que a maioria das células comece a se desprender; adicione 10 a 15 esferas de vidro às células e agite suavemente a placa. Em seguida, adicione dois mililitros de D-M-E-M-F 12 sem soro e pipeteie suavemente. Transfira a suspensão celular para um tubo de centrífuga de 10 mililitros.

Centrifugue as células a 800 RPM durante três minutos à temperatura ambiente. Aspire o sobrenadante, deixando o pellet de IPSCs humanos intacto. Agite suavemente o tubo para dispersar o pellet celular com cuidado.

Reese, suspenda o pellet de iPSCs humanas em um volume apropriado de meio STEM pro e distribua entre os poços de uma placa revestida com gel TRE. Dependendo da taxa de proliferação, as iPSCs humanas podem ser repassadas em uma razão de divisão de um para dois a um para seis. Coloque cuidadosamente a placa em uma incubadora com 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius e agite suavemente a placa para garantir uma distribuição uniforme das células pelos poços.

Alimente as células diariamente. Quando as células atingirem 80% de confluência, estarão prontas para serem repassadas novamente para um novo gel. Um poço revestido com Rex, dividido na proporção de um para dois, deve apresentar cerca de 40 a 50% de confluência e colônias pequenas distribuídas uniformemente no poço revestido com gel no dia da transfeção, a fim de obter eficiência ideal de transfeção.

Para iniciar este procedimento, prepare 100 microlitros de meio knockout em um tubo estéril de 1,5 mililitro. Adicione 27 microlitros do reagente de transfeção gene juice, misture bem e incube em temperatura ambiente por cinco minutos. Em seguida, adicione quatro microgramas de DNA plasmidial.

A escolha do plasmídeo é fundamental para uma eficiência ideal de transfeção. O plasmídeo utilizado aqui possui uma proteína verde fluorescente melhorada sob o controle de um promotor CAG, que é um promotor forte e ativo na transcrição em IPCs humanos. Incube o tubo em temperatura ambiente por 15 minutos.

Após 15 minutos, adicione a mistura de gene juice e DNA às células e agite a placa. Centrifugue a placa a 1.200 RPM por cinco minutos para aumentar o contato da mistura de transfeção com os IPCs humanos no poço. Incube as células a 37 graus Celsius durante a noite no dia seguinte.

Monitore a eficiência de transfeção no dia da transfeção nuclear. Pré-trate os CIPs humanos com inibidor de ROCK a 10 micromolar por pelo menos uma hora a 37 graus Celsius enquanto os CIPs humanos estão sendo pré-tratados. Prepare 82 microlitros de solução nucleofectante para células-tronco humanas em um tubo eppendorf estéril de 1,5 mililitro. Adicione 80 microlitros.

Adicione um suplemento e misture bem por pipetagem. Incube a solução a 37 graus Celsius por cinco minutos. Pré-aqueça, sob capela, o meio condicionado por células alimentadoras previamente preparado e a tripsina 0,25% com EDTA a 37 graus Celsius.

Pré-etiquete um tubo cônico estéril de 15 mililitros. Remova cuidadosamente o meio da cultura de iPSCs humanas a serem nucleofectadas e lave suavemente as células com solução salina tamponada com fosfato. Aspire o PBS e adicione tripsina, incubando as células a 37 graus Celsius por três minutos.

Para uma nucleofecção bem-sucedida, é fundamental não trypsinizar as células até a forma de células isoladas. Em vez disso, as células devem ser trituradas em pequenos aglomerados compostos por duas a três células. Remodele suavemente as células com a ponteira de uma pipeta P1000 em pequenos aglomerados constituídos por duas a três células.

Lave o fundo do poço com pipetagem repetida para garantir que todas as IPCs humanas estejam completamente destacadas. Em seguida, transfira a suspensão celular para o tubo cônico de 15 mililitros identificado. Depois, adicione nove mililitros de meio para fibroblastos embrionários de camundongo.

Para inativar a tripsina, centrifugue as células a 800 RPM durante três minutos. Aspire cuidadosamente o sobrenadante, deixando o pellet celular intacto. Suspenda as células em 100 microlitros de uma solução efetora nuclear de células-tronco humanas pré-aquecida.

Usando uma ponteira de pipeta de um mililitro, transfira as células para um vete de efetor nuclear. Adicione quatro microgramas de DNA plasmidial à suspensão celular no vete e misture as células e o DNA com movimentos suaves de rotação. Bata no vete duas vezes sobre a superfície da cabine de segurança.

Insira o vete no suporte do efetor nuclear do dispositivo de efetor nuclear. Selecione as células de efeito nuclear do programa B 0 1 6 pressionando o botão x. Okay será exibido quando o processo de afetação nuclear for concluído, o que geralmente leva de um a cinco segundos. Use a pipeta de plástico fornecida no kit de afetação nuclear para recuperar as células afetadas nuclearmente do vete; recupere as células por ressuspenção, suspendendo-as em CM pré-aquecido e inibidor de rock em um tubo estéril de 1,5 mililitro. Incube as células a 37 graus Celsius por 10 minutos.

Após 10 minutos, utilize uma ponteira de pipeta de um mililitro para transferir as células gota a gota para camadas de alimentação. Incube as células a 37 graus Celsius durante a noite no dia seguinte. Monitore a eficiência de transfeção.

Mostram-se aqui micrografias fotográficas de células de IPSC humanas RIV que expressam EGFP, transfetadas usando gene juice em gel Rex 12 horas após a transfeção com plasmídeo. Transfeção de DNA em IPsCs humanos. O uso de gene juice com um promotor forte normalmente resulta em mais de 60% das células expressando o repórter EGFP em um ensaio de transfeção transitória.

Células que expressam EGFP também podem ser obtidas por eletroporação nuclear, conforme ilustrado nestas imagens de IPCs humanos do RIV cultivados e formados sobre células de apoio após eletroporação nuclear utilizando o programa de eletroporação nuclear B 0 1 6 ou o programa A 0 2 3. O uso do programa B 0 1 6 resulta em até 80% de células positivas para EGFP, enquanto o programa A 0 2 3 gerou menos de 10% de células positivas para EGFP. Além disso, podem ser obtidos clones estáveis de iPSCs humanos transgênicos que expressam o gene de interesse.

Um exemplo de colônias de IPSC humanas estáveis expressando EGFP com expressão ubíqua de EGFP derivada do gene juice é mostrado aqui. Essas células mantêm a expressão constitutiva de EGFP durante a diferenciação em corpo embrionário. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar a nucleofecção e transfectar células IPS humanas.

A manipulação genética eficiente é uma ferramenta essencial para estudar diversos aspectos da biologia das células-tronco e acelerará o uso de linhagens de células iPS humanas na medicina regenerativa.