Isolando e cultivando pericitos cerebrais de camundongos

Adicione tampão ao tecido cerebral do camundongo e homogeneize-o para liberar células e microvasos.

Em seguida, adicione a solução de BSA-dextrano ao homogeneizado. Misture e centrifugue para separar os componentes. Descarte o sobrenadante.

Ressuspenda os microvasos em tampão e passe-os por um filtro, removendo os vasos maiores.

Agora, centrifugue o filtrado e remova o sobrenadante. Ressuspenda os microvasos em tampão contendo DNAses.

Adicione enzimas proteolíticas para liberar células endoteliais e pericitos.

DNases degradam o DNA.

Adicione tampão contendo BSA para interromper a atividade enzimática. Centrifugue e descarte o sobrenadante.

Ressuspenda as células no meio e coloque-as em uma placa de vários poços revestida com matriz basal. Incubar, promovendo a adesão celular.

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As células endoteliais formam uma monocamada e suportam o crescimento dos pericitos.

A passagem celular subsequente em meio de pericito em uma placa de vários poços revestida com gelatina promove o crescimento do pericito, eliminando as células endoteliais.

Comece colocando o cérebro de um camundongo C57 preto 6 macho de quatro a seis semanas de idade, livre de patógenos, em um lenço estéril, seco e sem fiapos e usando uma pinça de ponta curva para remover o cerebelo, o estriado e os nervos occipitais. Use um cotonete para remover todas as meninges visíveis e vire o tecido cerebral de cabeça para baixo. Abra os lóbulos com leves movimentos externos e remova todos os vasos sanguíneos visíveis. Em seguida, coloque o tecido cerebral livre de meninges em uma placa de Petri de 100 milímetros contendo 15 mililitros de tampão de lavagem a frio B.

Para homogeneizar o tecido, transfira a amostra de cérebro para um tubo de argamassa Dounce Tissue Grinder e adicione 3 a 4 mililitros de Washing Buffer B ao tubo. Use um pilão solto para picar o tecido 55 vezes. Em seguida, enxágue o pilão com o tampão de lavagem B e pique a pasta de tecido com um pilão apertado 25 vezes. Ao final da homogeneização, alíquota igualmente a pasta entre dois tubos de 50 mililitros e adicione 1,5 vezes o volume de albumina de soro bovino frio a 30% de dextrana. Em seguida, agite vigorosamente os tubos para misturar a pasta.

Para isolar a fração vascular, sedimentar as células por centrifugação e transferir os sobrenadantes para dois novos tubos. Armazene o pellet no tampão de lavagem B no gelo. Ressuspenda os pellets em três mililitros de tampão de lavagem a frio B no gelo.

Centrifugue os sobrenadantes colhidos e repita esta etapa mais uma vez. Descarte os sobrenadantes e ressuspenda os pellets em 3 mililitros de tampão de lavagem B. Em seguida, agrupe os pellets ressuspensos e leve o volume final das suspensões de células agrupadas para 10 mililitros com o Buffer B de lavagem a frio fresco.

Além disso, dissocie as células com uma pipeta de 10 milímetros seis vezes até que nenhum aglomerado restante de pellets seja visível e use um conjunto de filtro a vácuo e um filtro de malha de náilon para filtrar a suspensão celular. Coloque a peneira em uma placa de Petri e limpe a malha com o tampão de lavagem B fresco e raspe para recuperar os capilares. Em seguida, faça uma segunda filtragem com um filtro novo.

Dividir o filtrado em partes iguais entre dois tubos e recolher as células por centrifugação. Depois de descartar os sobrenadantes, agrupe os pellets em um único tubo contendo o tampão de lavagem B pré-aquecido com enzimas e adicione a dispersão de colagenase pré-aquecida ao tubo. Coloque o tubo em banho-maria de mesa agitada por precisamente 33 minutos a 37 graus Celsius antes de interromper a reação com 30 mililitros de tampão de lavagem a frio B.

Colete as células por centrifugação e descarte cuidadosamente o sobrenadante. Ressuspenda rápida mas cuidadosamente o pellet no tampão de lavagem B seis vezes e centrifugue novamente a suspensão. Depois de descartar o sobrenadante, ressuspender o pellet em mililitros de meio DMEM completo e semear 2 mililitros de suspensão celular em DMEM completo em nove poços de três placas de seis poços revestidas com Matrigel.

Coloque as culturas de células em uma incubadora estéril de dióxido de carbono a 37 graus Celsius e 5% por 24 horas antes de remover cuidadosamente os detritos de cada poço e adicione um novo meio DMEM. Após 48 horas, troque o meio em cada poço a cada 48 horas. No dia 8 a 10, quando as células atingirem 100% de confluência, passe as células em meio de cultura de parasitas para novas placas de seis poços revestidas com gelatina e retorne as células à incubadora de cultura de células por mais 6 a 7 dias com monitoramento.