Obtenção de uma suspensão unicelular do tecido hipocampal de camundongo
JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurociência
0 vistas • 3:42 min • July 8th, 2025
Pegue fragmentos de hipocampos de camundongos adultos perfundidos em um tubo de dissociação contendo papaína e DNase.
Coloque o tubo em um dissociador mecânico.
O dissociador desintegra mecanicamente o tecido, soltando células, incluindo neurônios e células gliais.
A papaína quebra a matriz extracelular do tecido, liberando células. DNase degrada o DNA contaminante.
Adicione tampão contendo BSA, inativando as enzimas.
Passe a suspensão por uma peneira para remover detritos grandes.
Centrifugar o filtrado. Descarte o sobrenadante rico em enzimas.
Ressuspenda as células em tampão e transfira-as para um novo tubo.
Adicione mídia de gradiente de densidade, misture e sobreponha a mistura com buffer.
Durante a centrifugação, as células e os detritos formam camadas separadas com base em suas densidades.
Remova a camada tampão superior e a camada intermediária de detritos.
Adicione buffer à camada inferior que contém as células e misture. Centrifugar e rejeitar o sobrenadante que contém o meio de gradiente de densidade.
Ressuspenda as células do hipocampo em tampão para análise posterior.
Usando uma pinça, transfira os pedaços de tecido do hipocampo para um tubo C e adicione 30 microlitros de mistura de enzimas 2 no tubo. Depois de torcer a tampa e apertar até ouvir um clique, coloque o tubo em um dissociador e execute o programa apropriado. Enquanto o programa está em execução, pré-molhe um filtro de células de 70 mícrons colocado em um tubo cônico de 50 mililitros com 2 mililitros de tampão BSA.
Após a conclusão do programa de dissociação, adicione 4 mililitros de tampão BSA ao tecido dissociado e filtre a mistura através do filtro de células no tubo cônico de 50 mililitros. Em seguida, adicione 10 mililitros de DPBS ao tubo C. Em seguida, feche o tubo, agite a solução suavemente e filtre-a através do filtro de células no tubo cônico de 50 mililitros. Centrifugar a suspensão de células filtradas. Rejeitar o sobrenadante sem perturbar o sedimento e conservá-lo.
Para remoção de detritos, ressuspenda o pellet com 1.550 microlitros de DPBS frio e transfira a suspensão para um tubo cônico de 15 mililitros rotulado. Em seguida, adicione 450 microlitros de solução de remoção de detritos frios e pipete para cima e para baixo. Cubra suavemente a suspensão celular com 1 mililitro de DPBS frio, mantendo a ponta contra a parede do tubo cônico. Repita o procedimento até que a sobreposição total seja de 2 mililitros.
Em seguida, centrifugue a suspensão a 3.000 vezes g por 10 minutos com aceleração total e freio total. Aspire a camada superior. Em seguida, varra a ponta da pipeta para frente e para trás para aspirar a camada intermediária branca. Remova o máximo possível da camada intermediária sem perturbar a camada inferior. Em seguida, adicione 2 mililitros de DPBS frio e pipete para cima e para baixo para misturar. Em seguida, centrifugue a suspensão a 1.000 vezes g por 10 minutos com aceleração total e freio total. Após a centrifugação, descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em tampão BSA de 1 mililitro.
Visão Geral
Este artigo detalha um protocolo para o isolamento de células do hipocampo de tecido de camundongo adulto utilizando dissociação enzimática e centrifugação em gradiente de densidade. O método tem como objetivo obter neurônios e células gliais viáveis para análises posteriores.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Engenharia de Tecidos
Antecedentes
- O hipocampo é essencial para a aprendizagem e a memória.
- O isolamento de células do hipocampo permite o estudo detalhado da função neuronal.
- A dissociação enzimática é um método comum para o isolamento de células.
- A centrifugação em gradiente de densidade ajuda a separar células com base em sua densidade.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método confiável para o isolamento de células do hipocampo.
- Garantir a viabilidade dos neurônios e das células gliais isoladas.
- Facilitar análises experimentais posteriores dessas células.
Métodos Utilizados
- Dissociação mecânica do tecido utilizando um dissociador.
- Tratamento enzimático com papaina e DNase para degradar a matriz extracelular.
- Centrifugação em gradiente de densidade para separar as células dos detritos.
- Filtração através de um filtro para células para remover partículas grandes.
Resultados Principais
- Isolamento bem-sucedido de neurônios e células gliais viáveis do hipocampo.
- Comprovação da remoção eficaz de detritos e contaminantes.
- Otimização do protocolo para melhorar o rendimento e a viabilidade celular.
- Estabelecimento de um método reprodutível para estudos futuros.
Conclusões
- O protocolo descrito é eficaz para o isolamento de células do hipocampo.
- Ele fornece uma base para pesquisas futuras sobre a função neuronal.
- Estudos futuros podem se basear neste método para explorar diversos aspectos da neurociência.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A obtenção de suspensões viáveis de células isoladas a partir de tecidos complexos, como o hipocampo, é fundamental para aplicações downstream na validação de alvos e na triagem fenotípica. Este protocolo permite o isolamento reprodutível de neurônios e células gliais, apoiando a desmistificação mecanicista na descoberta de fármacos em neurociência. O método fornece um sistema relevante para doenças na avaliação dos efeitos de compostos sobre a função celular e a modulação de vias.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de alvos neuronais e gliais do hipocampo em um microambiente semelhante ao natural.
- Valor Operacional: Produz células altamente viáveis, adequadas para ensaios funcionais e estudos de engajamento de alvos.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Gera uma população celular purificada para leituras de ensaio consistentes e menor variabilidade.
- Valor Operacional: Etapas de filtração e centrifugação garantem a remoção de detritos, melhorando a confiabilidade e escalabilidade do ensaio.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Fornece um sistema relevante para a doença para estudar mecanismos de aprendizado e memória, apoiando o alinhamento de biomarcadores.
- Valor Operacional: A centrifugação em gradiente de densidade permite a separação de células viáveis de contaminantes, apoiando fluxos de trabalho pré-clínicos reprodutíveis.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método insere-se no continuum de descoberta que vai da verificação da hipótese do alvo até o desenvolvimento de ensaios, fornecendo uma etapa confiável de preparação celular para validação funcional.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao fornecer neurônios e gliócitos do hipocampo viáveis para análise de vias.
- Triagem: Fornece uma suspensão padronizada e livre de detritos, permitindo triagem confiável de compostos.
- Análises: Permite medições quantitativas posteriores, como expressão de marcadores ou eletrofisiologia.
- Pesquisa Translacional: Conecta o isolamento do hipocampo à continuidade pré-clínica por meio do rendimento de células viáveis e funcionais.
- Reutilização Empresarial: O protocolo de dissociação e purificação é adaptável a diversos tipos de tecido neural, favorecendo a reutilização da plataforma.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva ao fornecer células neurais fisiologicamente relevantes.
- Valor Operacional: Etapas enzimáticas e mecânicas padronizadas melhoram a reprodutibilidade entre diferentes locais.
- Valor Estratégico: Reduz o ruído biológico em ensaios, favorecendo decisões mais precisas de avanço ou interrupção na validação de alvos.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos com base nas respostas funcionais de células do hipocampo.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência no manuseio de tecidos e na otimização da dissociação enzimática.
- Depende do acesso a um dissociador mecânico, peneiras celulares e equipamentos de centrifugação.
- Necessita padronização das concentrações de enzimas e do tempo de dissociação entre os usuários.
- O ajuste para outras regiões cerebrais pode exigir modificações na mistura enzimática e na força mecânica aplicada.
- A atividade enzimática residual deve ser completamente inativada para evitar danos celulares após a dissociação.
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Última atualização: 22 agosto 2026