Obtenção de uma suspensão unicelular do tecido hipocampal de camundongo

Pegue fragmentos de hipocampos de camundongos adultos perfundidos em um tubo de dissociação contendo papaína e DNase.

Coloque o tubo em um dissociador mecânico.

O dissociador desintegra mecanicamente o tecido, soltando células, incluindo neurônios e células gliais.

A papaína quebra a matriz extracelular do tecido, liberando células. DNase degrada o DNA contaminante.

Adicione tampão contendo BSA, inativando as enzimas.

Passe a suspensão por uma peneira para remover detritos grandes.

Centrifugar o filtrado. Descarte o sobrenadante rico em enzimas.

Ressuspenda as células em tampão e transfira-as para um novo tubo.

Adicione mídia de gradiente de densidade, misture e sobreponha a mistura com buffer.

Durante a centrifugação, as células e os detritos formam camadas separadas com base em suas densidades.

Remova a camada tampão superior e a camada intermediária de detritos.

Adicione buffer à camada inferior que contém as células e misture. Centrifugar e rejeitar o sobrenadante que contém o meio de gradiente de densidade.

Ressuspenda as células do hipocampo em tampão para análise posterior.

Usando uma pinça, transfira os pedaços de tecido do hipocampo para um tubo C e adicione 30 microlitros