Obtenção de uma suspensão unicelular do tecido hipocampal de camundongo

Pegue fragmentos de hipocampos de camundongos adultos perfundidos em um tubo de dissociação contendo papaína e DNase.

Coloque o tubo em um dissociador mecânico.

O dissociador desintegra mecanicamente o tecido, soltando células, incluindo neurônios e células gliais.

A papaína quebra a matriz extracelular do tecido, liberando células. DNase degrada o DNA contaminante.

Adicione tampão contendo BSA, inativando as enzimas.

Passe a suspensão por uma peneira para remover detritos grandes.

Centrifugar o filtrado. Descarte o sobrenadante rico em enzimas.

Ressuspenda as células em tampão e transfira-as para um novo tubo.

Adicione mídia de gradiente de densidade, misture e sobreponha a mistura com buffer.

Durante a centrifugação, as células e os detritos formam camadas separadas com base em suas densidades.

Remova a camada tampão superior e a camada intermediária de detritos.

Adicione buffer à camada inferior que contém as células e misture. Centrifugar e rejeitar o sobrenadante que contém o meio de gradiente de densidade.

Ressuspenda as células do hipocampo em tampão para análise posterior.

Usando uma pinça, transfira os pedaços de tecido do hipocampo para um tubo C e adicione 30 microlitros de mistura de enzimas 2 no tubo. Depois de torcer a tampa e apertar até ouvir um clique, coloque o tubo em um dissociador e execute o programa apropriado. Enquanto o programa está em execução, pré-molhe um filtro de células de 70 mícrons colocado em um tubo cônico de 50 mililitros com 2 mililitros de tampão BSA.

Após a conclusão do programa de dissociação, adicione 4 mililitros de tampão BSA ao tecido dissociado e filtre a mistura através do filtro de células no tubo cônico de 50 mililitros. Em seguida, adicione 10 mililitros de DPBS ao tubo C. Em seguida, feche o tubo, agite a solução suavemente e filtre-a através do filtro de células no tubo cônico de 50 mililitros. Centrifugar a suspensão de células filtradas. Rejeitar o sobrenadante sem perturbar o sedimento e conservá-lo.

Para remoção de detritos, ressuspenda o pellet com 1.550 microlitros de DPBS frio e transfira a suspensão para um tubo cônico de 15 mililitros rotulado. Em seguida, adicione 450 microlitros de solução de remoção de detritos frios e pipete para cima e para baixo. Cubra suavemente a suspensão celular com 1 mililitro de DPBS frio, mantendo a ponta contra a parede do tubo cônico. Repita o procedimento até que a sobreposição total seja de 2 mililitros.

Em seguida, centrifugue a suspensão a 3.000 vezes g por 10 minutos com aceleração total e freio total. Aspire a camada superior. Em seguida, varra a ponta da pipeta para frente e para trás para aspirar a camada intermediária branca. Remova o máximo possível da camada intermediária sem perturbar a camada inferior. Em seguida, adicione 2 mililitros de DPBS frio e pipete para cima e para baixo para misturar. Em seguida, centrifugue a suspensão a 1.000 vezes g por 10 minutos com aceleração total e freio total. Após a centrifugação, descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em tampão BSA de 1 mililitro.