Preparando uma suspensão unicelular de células imunes a partir de tecido cerebral murino

Comece com um cérebro murino com células neurais, não neurais e imunes dentro da matriz extracelular do cérebro ou ECM.

Pique o tecido e ressuspenda-o em um meio de cultura.

Transfira esses fragmentos de tecido para um tubo e trate-os com as enzimas colagenase e DNase-I.

A colagenase digere a MEC, liberando células individuais, enquanto a DNase-I degrada o DNA livre para evitar a aglomeração celular.

Em seguida, adicione EDTA para inativar as enzimas colagenase.

Adicione um meio de cultura. Centrifugue e remova o sobrenadante.

Adicione uma solução de gradiente de densidade e o meio de cultura ao pellet celular, criando uma camada de gradiente de baixa densidade.

Misture e depois subjaza a solução com uma solução de gradiente de alta densidade para estabelecer uma diferença de densidade.

Centrifugue em baixa velocidade para separar as células imunes na interface, com detritos celulares mais leves na parte superior e células neuronais e gliais mais pesadas na parte inferior.

Remova a camada superior, colete as células imunológicas e transfira-as para outro tubo.

Centrifugue e remova o sobrenadante e, em seguida, ressuspenda as células em um meio, formando uma suspensão de célula única para aplicações a jusante.

Despeje o tecido do cérebro ou da medula espinhal com a mídia em uma placa de Petri de 100 milímetros e use uma pinça para mover o tecido para o fundo. Pique o tecido cerebral com uma lâmina de barbear estéril e junte o tecido no fundo da placa. Adicione 3 mililitros de RPMI suplementado com 10% de FCS à placa de Petri e, em seguida, use uma pipeta sorológica de 10 mililitros para ressuspender o tecido no meio e transferi-lo para um tubo cônico de 15 mililitros.

Adicione colagenase tipo I e DNase I ao tecido e incube os tubos em banho-maria a 37 graus Celsius por 40 minutos. Inverta os tubos a cada 15 minutos para misturar completamente o tecido com as enzimas. Após a incubação, adicione EDTA a cada tubo para uma concentração final de 0,01 molar e incube os tubos por mais cinco minutos para inativar a colagenase.

Adicione 9 mililitros de RPMI, suplementado com 10% FCS a cada tubo e, em seguida, centrifugue os tubos a 450 g por 5 minutos a 4 graus Celsius. Use uma pipeta Pasteur com vácuo para aspirar o sobrenadante, tomando cuidado para não tocar no pellet celular.

Adicione 3 mililitros de solução de gradiente de densidade isotônica 100% ao pellet celular. Em seguida, adicione mídia RPMI 10% FCS adicional para trazer o volume final para 10 mililitros e ressuspender o pellet da célula. Inverta e misture bem o tubo. Em seguida, insira uma pipeta sorológica com 1 mililitro de solução de gradiente de densidade isotônica a 70% no fundo do tubo.

Espalhe lentamente a solução, tomando cuidado para não formar bolhas. Retirar a pipeta serológica do tubo, tomando o cuidado de não perturbar o gradiente. Centrifugue o tubo a 800 g por 30 minutos a 4 graus Celsius e, em seguida, aspire o sobrenadante, incluindo a camada de detritos de mielina, até que restem 2 a 3 mililitros no tubo.

Use uma pipeta de 1 mililitro para colher a camada de células entre o gradiente de densidade de 30% e 70% e transfira-a para um novo tubo de 15 mililitros. Adicione o meio RPMI 10% FCS para elevar o volume final a 15 mililitros e, em seguida, centrifugue as células a 450 g por 5 minutos a 4 graus Celsius.