Preparando uma suspensão unicelular de células imunes a partir de tecido cerebral murino
JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurociência
0 vistas • 3:51 min • July 8th, 2025
Comece com um cérebro murino com células neurais, não neurais e imunes dentro da matriz extracelular do cérebro ou ECM.
Pique o tecido e ressuspenda-o em um meio de cultura.
Transfira esses fragmentos de tecido para um tubo e trate-os com as enzimas colagenase e DNase-I.
A colagenase digere a MEC, liberando células individuais, enquanto a DNase-I degrada o DNA livre para evitar a aglomeração celular.
Em seguida, adicione EDTA para inativar as enzimas colagenase.
Adicione um meio de cultura. Centrifugue e remova o sobrenadante.
Adicione uma solução de gradiente de densidade e o meio de cultura ao pellet celular, criando uma camada de gradiente de baixa densidade.
Misture e depois subjaza a solução com uma solução de gradiente de alta densidade para estabelecer uma diferença de densidade.
Centrifugue em baixa velocidade para separar as células imunes na interface, com detritos celulares mais leves na parte superior e células neuronais e gliais mais pesadas na parte inferior.
Remova a camada superior, colete as células imunológicas e transfira-as para outro tubo.
Centrifugue e remova o sobrenadante e, em seguida, ressuspenda as células em um meio, formando uma suspensão de célula única para aplicações a jusante.
Despeje o tecido do cérebro ou da medula espinhal com a mídia em uma placa de Petri de 100 milímetros e use uma pinça para mover o tecido para o fundo. Pique o tecido cerebral com uma lâmina de barbear estéril e junte o tecido no fundo da placa. Adicione 3 mililitros de RPMI suplementado com 10% de FCS à placa de Petri e, em seguida, use uma pipeta sorológica de 10 mililitros para ressuspender o tecido no meio e transferi-lo para um tubo cônico de 15 mililitros.
Adicione colagenase tipo I e DNase I ao tecido e incube os tubos em banho-maria a 37 graus Celsius por 40 minutos. Inverta os tubos a cada 15 minutos para misturar completamente o tecido com as enzimas. Após a incubação, adicione EDTA a cada tubo para uma concentração final de 0,01 molar e incube os tubos por mais cinco minutos para inativar a colagenase.
Adicione 9 mililitros de RPMI, suplementado com 10% FCS a cada tubo e, em seguida, centrifugue os tubos a 450 g por 5 minutos a 4 graus Celsius. Use uma pipeta Pasteur com vácuo para aspirar o sobrenadante, tomando cuidado para não tocar no pellet celular.
Adicione 3 mililitros de solução de gradiente de densidade isotônica 100% ao pellet celular. Em seguida, adicione mídia RPMI 10% FCS adicional para trazer o volume final para 10 mililitros e ressuspender o pellet da célula. Inverta e misture bem o tubo. Em seguida, insira uma pipeta sorológica com 1 mililitro de solução de gradiente de densidade isotônica a 70% no fundo do tubo.
Espalhe lentamente a solução, tomando cuidado para não formar bolhas. Retirar a pipeta serológica do tubo, tomando o cuidado de não perturbar o gradiente. Centrifugue o tubo a 800 g por 30 minutos a 4 graus Celsius e, em seguida, aspire o sobrenadante, incluindo a camada de detritos de mielina, até que restem 2 a 3 mililitros no tubo.
Use uma pipeta de 1 mililitro para colher a camada de células entre o gradiente de densidade de 30% e 70% e transfira-a para um novo tubo de 15 mililitros. Adicione o meio RPMI 10% FCS para elevar o volume final a 15 mililitros e, em seguida, centrifugue as células a 450 g por 5 minutos a 4 graus Celsius.
Visão Geral
Este artigo detalha um método para o isolamento de células imunes a partir de tecido cerebral murino. O processo envolve a digestão enzimática da matriz extracelular e posterior centrifugação em gradiente de densidade para separar os tipos celulares.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Imunologia
Antecedentes
- O entendimento da dinâmica das células imunes no cérebro é fundamental para a pesquisa em neurociência.
- O isolamento de tipos celulares específicos permite o estudo detalhado de suas funções.
- As técnicas de digestão enzimática são comumente usadas para liberar células do tecido.
- A centrifugação em gradiente de densidade auxilia na separação de diferentes populações celulares.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método confiável para o isolamento de células imunes de tecido cerebral murino.
- Facilitar aplicações posteriores em neurociência e imunologia.
- Aprimorar a compreensão das respostas imunes no sistema nervoso central.
Métodos Utilizados
- O tecido cerebral murino é picado e tratado com colagenase e DNase-I.
- O EDTA é adicionado para inativar a colagenase após a digestão.
- Soluções de gradiente de densidade são usadas para separar células imunes de outros tipos celulares.
- Uma centrifugação é realizada para isolar as populações celulares desejadas.
Resultados Principais
- Realizou-se com sucesso o isolamento de células imunes a partir de tecido cerebral.
- O método permite a coleta de uma suspensão de células únicas.
- A viabilidade e a funcionalidade celulares foram mantidas durante todo o processo.
- As células imunes isoladas podem ser utilizadas em diversas aplicações posteriores.
Conclusões
- O método descrito é eficaz para o isolamento de células imunes de tecido cerebral murino.
- Essa técnica pode avançar a pesquisa em neuroimunologia.
- Estudos futuros podem explorar os papéis dessas células imunes em doenças neurológicas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O isolamento de células imunes de tecido cerebral murino permite a desmistificação mecanicista na validação de alvos em neuroimunologia, fornecendo um sistema relevante para a doença para interrogatório funcional. Esta abordagem apoia a triagem fenotípica e o desenvolvimento de ensaios para terapêuticas moduladoras do SNC, melhorando a confiança preditiva no estágio inicial de descoberta. O método facilita o alinhamento de biomarcadores translacionais e a continuidade do modelo pré-clínico para indicações neurológicas mediadas por imunidade.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas sobre a função das células imunes na patologia do SNC.
- Valor Operacional: Fornece um sistema biológico reprodutível para a clarificação de vias e redução de riscos em alvos terapêuticos.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao reduzir a ambiguidade mecanicista na seleção de alvos neuroimunes.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Prepara suspensões de células imunes validadas para ensaios funcionais e fenotípicos posteriores.
- Valor Operacional: Garante a padronização dos ensaios por meio do isolamento celular e viabilidade consistentes.
- Escalabilidade: Permite a reutilização da plataforma em campanhas de triagem de compostos direcionadas a vias neuroinflamatórias.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Conecta descobertas científicas à validação pré-clínica utilizando sistemas de células imunes relevantes para a doença.
- Alinhamento de Biomarcadores: Apoia a identificação e validação de biomarcadores translacionais a partir de populações imunes do SNC isoladas.
- Avanço com Base no Risco: Orienta decisões de prosseguimento ou interrupção do desenvolvimento ao fornecer leituras mecanicistas do engajamento do alvo em células imunes.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método posiciona o isolamento de células imunes como uma etapa inicial crítica que permite a identificação de compostos promissores e a validação pré-clínica em programas de neuroimunologia.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a redução de riscos biológicos de alvos imunes do SNC por meio da análise funcional direta.
- Triagem: Fornece suspensões celulares prontas para ensaios, reprodutíveis, para triagem quantitativa de compostos e validação de alvos.
- Análises: Gera suspensões viáveis de células únicas, permitindo citometria de fluxo, expressão gênica e leituras funcionais para análise comparativa entre condições.
- Pesquisa Translacional: Relaciona fenótipos de células imunes a modelos pré-clínicos de doenças por meio de populações isoladas com relevância funcional.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma capacidade padronizada de isolamento aplicável a múltiplos projetos de neuroimunologia e classes de alvos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade mecanicista nas vias neuroimunes.
- Valor Operacional: Oferece padronização, reprodutibilidade e escalabilidade no preparo de células imunes para aplicações posteriores.
- Valor Estratégico: Melhora a qualidade das decisões de avanço ou interrupção de projetos e a eficiência do capital ao permitir a eliminação precoce de riscos biológicos.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de alvos do sistema nervoso central por meio de ensaios funcionais baseados em células imunes validados.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em dissociação tecidual, digestão enzimática e técnicas de centrifugação em gradiente de densidade.
- Depende do acesso a equipamentos de centrifugação, reagentes enzimáticos (colagenase, DNase-I, EDTA) e soluções de gradiente.
- Necessita padronização entre equipes dos protocolos de isolamento para garantir a reprodutibilidade entre unidades de descoberta e pré-clínicas.
- Requer considerações de adaptação ao aplicar o método a outros tecidos neurais ou modelos de doenças.
- Limitações práticas incluem a variabilidade do tecido e a necessidade de otimização enzimática para manter a viabilidade e funcionalidade das células imunes.
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Última atualização: 22 agosto 2026