Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Neurociência
0 visualizações • 4:27 min. • July 8th, 2025
Pegue uma cauda bovina.
Remova o tecido sobrejacente e os processos vertebrais e, em seguida, corte transversalmente para obter segmentos.
Identifique o disco intervertebral ou IVD, localizado entre as placas de crescimento e as placas terminais vertebrais.
Corte em ambos os lados do IVD e coloque-o em um prato contendo gaze embebida em tampão para manter a viabilidade do tecido.
Raspe qualquer tecido vertebral anexado e meça a altura do IVD.
Lave com tampão para remover restos de sangue e desinfete o IVD em um tampão contendo antibióticos.
Coloque os IVDs em câmaras de biorreatores contendo meios.
O meio no grupo fisiológico tem glicose alta, enquanto no grupo patológico, um meio com baixo teor de glicose induz a privação de nutrientes.
Coloque as câmaras no biorreator.
Para o IVD fisiológico, aplique uma carga suave diariamente. Para o DIV patológico, aplique uma carga intensa a uma taxa mais alta diariamente.
Entre os testes de carga diários, permita que os IVDs se recuperem no meio.
Após todos os procedimentos de carregamento, meça as alturas do IVD.
Uma altura reduzida nos DIVs patológicos indica uma condição degenerativa e pró-inflamatória.
Comece enxaguando bem toda a cauda bovina com água da torneira para remover a sujeira e os pelos da superfície. Em seguida, mergulhe a cauda em solução de betadina a 1% por 10 minutos para desinfetar a superfície. Use um bisturi número 20 para remover o tecido mole da coluna caudal para facilitar a identificação dos discos intervertebrais ou DIVs.
Remova os processos espinhosos e transversos das vértebras com um alicate de remoção óssea. Corte transversalmente com um alicate de osso no meio de cada corpo vertebral para obter segmentos de movimento individuais e, em seguida, coloque os segmentos de movimento coletados em uma placa de Petri com uma gaze umedecida na solução de Ringer.
Localize o IVD e as vértebras movendo os segmentos de movimento suavemente. Em seguida, identifique a localização da placa de crescimento tocando e encontrando o lado convexo da placa terminal óssea. Resfrie a lâmina da serra de fita com a solução de Ringer e use-a para fazer dois cortes paralelos na placa de crescimento dos IVDs, um de cada lado.
Transfira os IVDs para uma placa de Petri limpa com gaze limpa umedecida com solução de Ringer. Raspe o corpo vertebral e a placa de crescimento usando a lâmina do bisturi, deixando a placa terminal intacta. Posicione as duas superfícies planas e paralelas para o procedimento de carregamento e transfira os IVDs raspados para uma placa de Petri fresca com gaze umedecida com solução de Ringer.
Meça a altura e o diâmetro do disco com um paquímetro. Em seguida, limpe os coágulos sanguíneos no osso das vértebras com a solução de Ringer usando um sistema de lavagem a jato. Desinfete os DIVs em PBS e penicilina-estreptomicina a 10%, agitando por 15 minutos. Enxágue os antibióticos de alta concentração com PBS e estreptomicina de penicilina a 1%.
Transfira os discos para câmaras de IVD contendo 5 mililitros de meio de cultura de IVD e coloque-os no sistema de biorreator com uma incubadora a 37 graus Celsius com 85% de umidade e 5% de dióxido de carbono. Cultivar os discos por quatro dias dentro de um sistema de biorreator, mantendo diferentes condições de carregamento de acordo com os grupos experimentais.
No grupo controle fisiológico, cultivar os DIVs com meio de glicose alta usando um protocolo de carga de 0,02 a 0,2 megapascais e 0,2 Hertz por duas horas por dia. No grupo patológico, cultivar os DIVs com meio de baixa glicose usando um protocolo de carga de 0,32 a 0,5 megapascais e 5 Hertz por duas horas por dia.
Entre os procedimentos de carregamento, coloque os IVDs em placas de seis poços com 7 mililitros de meio de cultura IVD para recuperação livre do inchaço. Medir a altura do disco diariamente com um paquímetro após o período de dilatação livre e após carga dinâmica durante a duração experimental.